Moleculaire biologie periode 3+4
Nucleïnezuren extraheren
Medische/klinische toepassingen
o Microbiologie: detectie van virussen, bacteriën en parasieten, ziekte monitoring
o Oncologie: diagnose en prognose van tumoren, ziekte monitoring (MRD)
o Genetica: bestuderen genetische ziekte, prenataal als postnataal
Forensische toepassingen (gerechtelijke)
o sporenonderzoek
o vaderschapsanalyse
Voedselveiligheid
o in voedsel bacteriën of virussen gaan opsporen
gemeenschappelijke al deze toepassingen: moleculaire technieken enorm gevoelig zijn, drm ander
technieken hebben vervagen want die zijn minder gevoelig
minste sporen bacterie of virus in voedsel kan je da gaan opsporen: belangrijk: heel kleine
besmetting met bacterie kan gevaarlijk zijn
bv klinische vragen:
Heeft deze persoon een besmetting van het corona virus?
Stalen
o Wisser
o Perifeer bloed:
WBC
cfDNA/ctDNA
Beenmerg, CSV,…
Urine/faeces
Weefsel
Chorionvilli (vlokkentest vanaf 11w)
Amnionvocht (vruchtwaterpunctie vanaf 15w)
DNA of RNA?
DNA zeer stabiel, RNA zeer instabiel
Als we kunnen kiezen we DNA, maar uitzonderingen:
o RNA virussen: gen. Mat. opsporen om te diagnosticeren van besmetting persoon, RNA
extraheren, RNA omzetten in cDNA (mbv retrotranscriptase), volgende stappen zelfde
o Genexpressie: bv tumor doordat die een bep gen extra hoog tot expressie brengt, RNA
extraheren, omzetten in cDNA, kwantificeren
, o Translocaties: groen: abel gen, blauw pcr
gen, rode pijltjes: plekjes waar gen kan
breken en recombineren met andere gen
=> fusie genen krijgt: deze kunnen
verschillende zijn en op gen niveau
RNA niveau: onderaan: 2 transcripten,
verschillend, resultaat andere translocatie,
maar op mRNA niveau geen groot verschil:
1 PCR designen zowel bovenste als
onderste translocatie gaat opsporen
Hoog tot expressie gebracht, heel veel
mRNA van fusie genen: techniek extra
gevoelig wordt: makkelijker om fusie
transcript op te sporen dan fusie op DNA
niveau
Verschillende stappen doorlopen
vertrekkende vanaf biopsie
Tumor ontdekt, verwijderd, stukje
weefsel meenemen = biopt, specifieke
stappen ondergaan, in paraffine blokje
plaatsen, koepes snijden, DNA extractie
start
Opslag: afhankelijk van toepassing 4°C of
-20°C, lang houdbaar en met RNA werken ook cDNA: lang houdbaar, wel vries-dooi cycli beperken
(beter niet 10x ontdooien en terug invriezen, dan gwn beter op 4°C bewaren, Door dooicycli:
degradatie van DNA, niet voor alle toepassingen slecht, maar voor sommige wel)
Voor uiteindelijke moleculaire diagnostisch luik komen: DNA kwantificeren voor enerzijds altijd met
zelfde conc DNA/RNA verder te werken anderzijds ook om niet verder te werken met stalen waar zwz
te weinig in zit
Veel verschillende manieren om DNA te extraheren: 3 manieren
o Organische extractie: gebruik van organische solventen, heel ongezond, zelden of nooit meer
toegevoegd
o Chelex extractie: goedkoop, simpele manier voor DNA te extraheren, nadeel: extract heeft
nog heel veel onzuiverheden: PCR mogelijk
o Solid phase extractie: continu gebruikt, heel zuiver DNA geven, heel kleine hoeveelheden
zuiver kunnen bekomen worden
Organische extractie
o Vertrek: cellen in vloeistof eventueel enzym nog toevoegen dat van weefsel losse cellen
maakt bv proteinase K
o dan cellen lyseren
o cellysaat bekomen: hierin resten membranen, eiwitten, zouten
o deze scheiden van elkaar door organisch solvent toe te voegen: PCIA
, o vortexen en centrifugeren
o 2 fasen bekomen: bovenaan
waterfase met DNA, dartussen
tussen/interfase met eiwitten,
onderaan lipiden
o Bovenste fase afpipetteren in
andere tube: hierin DNA:
redelijk zuiver
Chelex extractie:
o Vertrek: cellen in suspensie in alkalische buffer
o Chelex toevoegen
o Opkoken: cellen lyseren tijdens dit en eiwitten
denatureren: DNA komt vrij en chelex gaat
divalente kationen binden en inhiberen
o Centrifugeren: supernatans krijgen
o Supernatans overpipetteren in andere tube =
DNA extract: is niet super zuiver
Chelex: polymeerbolletjes waar aan buitenkant zure groepen aanwezig zijn: carboxylgroepen, en in
alkalisch milieu allemaal negatief geladen: 2 negatieve ladingen bijeen: ideaal divalente kationen aan
te trekken
Co-factoren voor nucleasen: enzymen die DNA afbreken
Solid phase extractie:
o Wat is vaste fase? In deze figuur:
paramagnetische beats: DNA binden en
tegelijkertijd door magneet
aangetrokken kunnen worden
o Onderverdelen in 2 grote groepen:
technieken werken met
paramagnetische beats en technieken
die werken met kolommen
Met silicakolom:
Heel veel zouten aanwezig vanaf het begin: zout interactie tussen waterstofmoleculen in
wateroplossing verstoort: gaotroop zout: essentieel om binding DNA mogelijk te maken voor
vorming zoutbrug maar anderzijds ook effect op eiwitten: interageren: driedimensionale structuur
Nucleïnezuren extraheren
Medische/klinische toepassingen
o Microbiologie: detectie van virussen, bacteriën en parasieten, ziekte monitoring
o Oncologie: diagnose en prognose van tumoren, ziekte monitoring (MRD)
o Genetica: bestuderen genetische ziekte, prenataal als postnataal
Forensische toepassingen (gerechtelijke)
o sporenonderzoek
o vaderschapsanalyse
Voedselveiligheid
o in voedsel bacteriën of virussen gaan opsporen
gemeenschappelijke al deze toepassingen: moleculaire technieken enorm gevoelig zijn, drm ander
technieken hebben vervagen want die zijn minder gevoelig
minste sporen bacterie of virus in voedsel kan je da gaan opsporen: belangrijk: heel kleine
besmetting met bacterie kan gevaarlijk zijn
bv klinische vragen:
Heeft deze persoon een besmetting van het corona virus?
Stalen
o Wisser
o Perifeer bloed:
WBC
cfDNA/ctDNA
Beenmerg, CSV,…
Urine/faeces
Weefsel
Chorionvilli (vlokkentest vanaf 11w)
Amnionvocht (vruchtwaterpunctie vanaf 15w)
DNA of RNA?
DNA zeer stabiel, RNA zeer instabiel
Als we kunnen kiezen we DNA, maar uitzonderingen:
o RNA virussen: gen. Mat. opsporen om te diagnosticeren van besmetting persoon, RNA
extraheren, RNA omzetten in cDNA (mbv retrotranscriptase), volgende stappen zelfde
o Genexpressie: bv tumor doordat die een bep gen extra hoog tot expressie brengt, RNA
extraheren, omzetten in cDNA, kwantificeren
, o Translocaties: groen: abel gen, blauw pcr
gen, rode pijltjes: plekjes waar gen kan
breken en recombineren met andere gen
=> fusie genen krijgt: deze kunnen
verschillende zijn en op gen niveau
RNA niveau: onderaan: 2 transcripten,
verschillend, resultaat andere translocatie,
maar op mRNA niveau geen groot verschil:
1 PCR designen zowel bovenste als
onderste translocatie gaat opsporen
Hoog tot expressie gebracht, heel veel
mRNA van fusie genen: techniek extra
gevoelig wordt: makkelijker om fusie
transcript op te sporen dan fusie op DNA
niveau
Verschillende stappen doorlopen
vertrekkende vanaf biopsie
Tumor ontdekt, verwijderd, stukje
weefsel meenemen = biopt, specifieke
stappen ondergaan, in paraffine blokje
plaatsen, koepes snijden, DNA extractie
start
Opslag: afhankelijk van toepassing 4°C of
-20°C, lang houdbaar en met RNA werken ook cDNA: lang houdbaar, wel vries-dooi cycli beperken
(beter niet 10x ontdooien en terug invriezen, dan gwn beter op 4°C bewaren, Door dooicycli:
degradatie van DNA, niet voor alle toepassingen slecht, maar voor sommige wel)
Voor uiteindelijke moleculaire diagnostisch luik komen: DNA kwantificeren voor enerzijds altijd met
zelfde conc DNA/RNA verder te werken anderzijds ook om niet verder te werken met stalen waar zwz
te weinig in zit
Veel verschillende manieren om DNA te extraheren: 3 manieren
o Organische extractie: gebruik van organische solventen, heel ongezond, zelden of nooit meer
toegevoegd
o Chelex extractie: goedkoop, simpele manier voor DNA te extraheren, nadeel: extract heeft
nog heel veel onzuiverheden: PCR mogelijk
o Solid phase extractie: continu gebruikt, heel zuiver DNA geven, heel kleine hoeveelheden
zuiver kunnen bekomen worden
Organische extractie
o Vertrek: cellen in vloeistof eventueel enzym nog toevoegen dat van weefsel losse cellen
maakt bv proteinase K
o dan cellen lyseren
o cellysaat bekomen: hierin resten membranen, eiwitten, zouten
o deze scheiden van elkaar door organisch solvent toe te voegen: PCIA
, o vortexen en centrifugeren
o 2 fasen bekomen: bovenaan
waterfase met DNA, dartussen
tussen/interfase met eiwitten,
onderaan lipiden
o Bovenste fase afpipetteren in
andere tube: hierin DNA:
redelijk zuiver
Chelex extractie:
o Vertrek: cellen in suspensie in alkalische buffer
o Chelex toevoegen
o Opkoken: cellen lyseren tijdens dit en eiwitten
denatureren: DNA komt vrij en chelex gaat
divalente kationen binden en inhiberen
o Centrifugeren: supernatans krijgen
o Supernatans overpipetteren in andere tube =
DNA extract: is niet super zuiver
Chelex: polymeerbolletjes waar aan buitenkant zure groepen aanwezig zijn: carboxylgroepen, en in
alkalisch milieu allemaal negatief geladen: 2 negatieve ladingen bijeen: ideaal divalente kationen aan
te trekken
Co-factoren voor nucleasen: enzymen die DNA afbreken
Solid phase extractie:
o Wat is vaste fase? In deze figuur:
paramagnetische beats: DNA binden en
tegelijkertijd door magneet
aangetrokken kunnen worden
o Onderverdelen in 2 grote groepen:
technieken werken met
paramagnetische beats en technieken
die werken met kolommen
Met silicakolom:
Heel veel zouten aanwezig vanaf het begin: zout interactie tussen waterstofmoleculen in
wateroplossing verstoort: gaotroop zout: essentieel om binding DNA mogelijk te maken voor
vorming zoutbrug maar anderzijds ook effect op eiwitten: interageren: driedimensionale structuur
