Examenvragen scheiding
1. Beschrijf het concept van de theoretisch platen. Illustreer waar mogelijk. Hoe berekenen
we deze?
Het concept van theoretische platen is gebaseerd op het aantal evenwichten tussen de mobiele en
stationaire fase die plaats kunnen vinden gedurende het scheidingsproces. Hoe meer evenwichten er
zullen plaatsvinden, hoe beter het scheidingsproces, dus hoe efficiënter de kolom. Echter de kwaliteit
van de kolom kan verschillen naargelang de condities. Daarom is N = L/H met L de lengte van de
kolom en H de hoogte-equivalent van 1 theoretische plaat. Dus daar waar de N bruikbaar is om de
veranderde efficiëntie van een bepaalde kolom onder verschillende condities te meten Verschillende
factoren kunnen H beïnvloeden, zoals de bv. snelheid waarmee de stof door de kolom loopt, de
viscositeit van het solvent, de korrelgrootte van de matrix… H wordt uitgedrukt in µm.
Het aantal theoretische platen berekenen, gaat als volgt. Men kan de plaathoogte H berekenen die
op zijn beurt gecorreleerd is met de piekbreedte van de eluerende stof. De piekbreedte is namelijk
door diffusie normaal verdeeld over een bepaald volume V e gedurende een bepaalde tijd.
2. Teken een Van Deemter curve. Aan welke vergelijking beantwoordt deze? Bespreek de
verschillende termen uit de vergelijking en duid ze aan op de figuur.
B
H= A + +CF met A de bijdrage van de Eddy diffusie, B/F de bijdrage van
F
de longitudinale diffusie en CF de term voor de massa-overdracht. Deze
vergelijking beschrijft een rechthoekige hyperbool met een minimale
B
plaathoogte voor een optimaal debiet FO =
√ C
en Hmin = A+2 √ BC .
Uit de vorm van de Van Deemter plot kan informatie worden bekomen
omtrent de verschillende effecten die bijdragen tot de bandverbreding. De parameters A, B en C zijn
verschillend voor elke kolom en worden experimenteel bepaald uit de grafische uitzetting van de Van
Deemter vergelijking. A is de doorsnede van de asymptoot met de Y-as, C is de richtingscoëfficiënt
van de asymptoot en B kan berekend worden uit de waarde voor H min of FO.
De niet-uniforme stroming (Eddy diffusie) van de mobiele fase. Door kanaalvorming kan de
stroomsnelheid en afgelegde afstand sterk variëren doorheen de kolom. De verbreding door Eddy
diffusie is evenredig met de lengte van de kolom en de diameter van de deeltjes (σ²= AL).
, De longitudinale diffusie van de opgeloste stof. Opgeloste stoffen verblijven eenzelfde tijd in de
mobiele fase. In deze fase ontstaat bandverbreding door diffusie. Deze is evenredig met de lengte
van de kolom en omgekeerd evenredig met de lineaire snelheid v (debiet F) van de mobiele fase (σ² =
(B/F)L).
De effecten van massa-overdracht. De chromatograferende stof wordt continue geadsorbeerd en
gedesorbeerd van de stationaire fase. Bij desorptie van de matrix komt de stof soms terecht aan de
achterkant van de chromatograferende zone. Dit gebeurt omdat niet alle partikels tegelijk
desorberen. Het effect is evenredig met de lengte van de kolom en de snelheid v van de eluerende
stof (σ² = (CF)L).
3. Beschouw het volgend chromatogram. Welke chromatografieën
zouden zijn gebruikt wanneer:
- 1 = laag MW en 6 = hoog MW, beide zelfde lading
- 1 = kation en 6 = anion
- 1 = hoog MW en 6 = laag MW
- 1 = weinig hydrofoob en 6 = meer hydrofoob onder natieve
omstandigheden
Omgekeerde fase chromatografie
Anion uitwisselingschromatografie (omgekeerde fase niet uit te sluiten)
Gelfiltratie (omgekeerde fase niet uit te sluiten)
Hydrofobe interactie chromatografie
4. Is het mogelijk door chromatografie om 1 eiwit uit een mengsel op te zuiveren? Licht toe in
een paar zinnen.
Ja, door affiniteitschromatografie, bv. “Immobilized Metal Affinity Chromatography” of IMAC.
Wanneer het eiwit door genetische manipulatie is voorzien van een N-terminale thrombine
herkenningsplaats gevolgd door een histidine-rijk etiket (His-tag). Dit eiwit kan via de His-tag selectief
binden op korrels (stationaire fase) welke een gecheleerd metaal bevatten (bv. Ni 2+, Co2+). Na
incubatie wordt de rest van het mengsel weggewassen en het gebonden eiwit kan geëlueerd worden
van de korrels door behandeling van de korrels met thrombine zodat het eiwit vrijkomt en de
thrombine herkenningsplaats + de His-tag achterblijf op de korrels.
5. Welke polymeren worden veel gebruikt voor gelelektroforese? Kan je er een tekenen?
Agarose, polyacrylamide (zie apart blad).
6. Waarin vooral onderscheidt dunnelaag elektroforese zich van dunnelaag chromatografie?
Door de manier waarop de macromoleculen in beweging worden gebracht. Bij dunnelaag
chromatografie is dit capillaire kracht van het solvent, bij dunnelaag elektroforese is dit een
elektrisch veld waarbij de geladen macromoleculen aangetrokken worden naar één van de twee
elektrodes.
1. Beschrijf het concept van de theoretisch platen. Illustreer waar mogelijk. Hoe berekenen
we deze?
Het concept van theoretische platen is gebaseerd op het aantal evenwichten tussen de mobiele en
stationaire fase die plaats kunnen vinden gedurende het scheidingsproces. Hoe meer evenwichten er
zullen plaatsvinden, hoe beter het scheidingsproces, dus hoe efficiënter de kolom. Echter de kwaliteit
van de kolom kan verschillen naargelang de condities. Daarom is N = L/H met L de lengte van de
kolom en H de hoogte-equivalent van 1 theoretische plaat. Dus daar waar de N bruikbaar is om de
veranderde efficiëntie van een bepaalde kolom onder verschillende condities te meten Verschillende
factoren kunnen H beïnvloeden, zoals de bv. snelheid waarmee de stof door de kolom loopt, de
viscositeit van het solvent, de korrelgrootte van de matrix… H wordt uitgedrukt in µm.
Het aantal theoretische platen berekenen, gaat als volgt. Men kan de plaathoogte H berekenen die
op zijn beurt gecorreleerd is met de piekbreedte van de eluerende stof. De piekbreedte is namelijk
door diffusie normaal verdeeld over een bepaald volume V e gedurende een bepaalde tijd.
2. Teken een Van Deemter curve. Aan welke vergelijking beantwoordt deze? Bespreek de
verschillende termen uit de vergelijking en duid ze aan op de figuur.
B
H= A + +CF met A de bijdrage van de Eddy diffusie, B/F de bijdrage van
F
de longitudinale diffusie en CF de term voor de massa-overdracht. Deze
vergelijking beschrijft een rechthoekige hyperbool met een minimale
B
plaathoogte voor een optimaal debiet FO =
√ C
en Hmin = A+2 √ BC .
Uit de vorm van de Van Deemter plot kan informatie worden bekomen
omtrent de verschillende effecten die bijdragen tot de bandverbreding. De parameters A, B en C zijn
verschillend voor elke kolom en worden experimenteel bepaald uit de grafische uitzetting van de Van
Deemter vergelijking. A is de doorsnede van de asymptoot met de Y-as, C is de richtingscoëfficiënt
van de asymptoot en B kan berekend worden uit de waarde voor H min of FO.
De niet-uniforme stroming (Eddy diffusie) van de mobiele fase. Door kanaalvorming kan de
stroomsnelheid en afgelegde afstand sterk variëren doorheen de kolom. De verbreding door Eddy
diffusie is evenredig met de lengte van de kolom en de diameter van de deeltjes (σ²= AL).
, De longitudinale diffusie van de opgeloste stof. Opgeloste stoffen verblijven eenzelfde tijd in de
mobiele fase. In deze fase ontstaat bandverbreding door diffusie. Deze is evenredig met de lengte
van de kolom en omgekeerd evenredig met de lineaire snelheid v (debiet F) van de mobiele fase (σ² =
(B/F)L).
De effecten van massa-overdracht. De chromatograferende stof wordt continue geadsorbeerd en
gedesorbeerd van de stationaire fase. Bij desorptie van de matrix komt de stof soms terecht aan de
achterkant van de chromatograferende zone. Dit gebeurt omdat niet alle partikels tegelijk
desorberen. Het effect is evenredig met de lengte van de kolom en de snelheid v van de eluerende
stof (σ² = (CF)L).
3. Beschouw het volgend chromatogram. Welke chromatografieën
zouden zijn gebruikt wanneer:
- 1 = laag MW en 6 = hoog MW, beide zelfde lading
- 1 = kation en 6 = anion
- 1 = hoog MW en 6 = laag MW
- 1 = weinig hydrofoob en 6 = meer hydrofoob onder natieve
omstandigheden
Omgekeerde fase chromatografie
Anion uitwisselingschromatografie (omgekeerde fase niet uit te sluiten)
Gelfiltratie (omgekeerde fase niet uit te sluiten)
Hydrofobe interactie chromatografie
4. Is het mogelijk door chromatografie om 1 eiwit uit een mengsel op te zuiveren? Licht toe in
een paar zinnen.
Ja, door affiniteitschromatografie, bv. “Immobilized Metal Affinity Chromatography” of IMAC.
Wanneer het eiwit door genetische manipulatie is voorzien van een N-terminale thrombine
herkenningsplaats gevolgd door een histidine-rijk etiket (His-tag). Dit eiwit kan via de His-tag selectief
binden op korrels (stationaire fase) welke een gecheleerd metaal bevatten (bv. Ni 2+, Co2+). Na
incubatie wordt de rest van het mengsel weggewassen en het gebonden eiwit kan geëlueerd worden
van de korrels door behandeling van de korrels met thrombine zodat het eiwit vrijkomt en de
thrombine herkenningsplaats + de His-tag achterblijf op de korrels.
5. Welke polymeren worden veel gebruikt voor gelelektroforese? Kan je er een tekenen?
Agarose, polyacrylamide (zie apart blad).
6. Waarin vooral onderscheidt dunnelaag elektroforese zich van dunnelaag chromatografie?
Door de manier waarop de macromoleculen in beweging worden gebracht. Bij dunnelaag
chromatografie is dit capillaire kracht van het solvent, bij dunnelaag elektroforese is dit een
elektrisch veld waarbij de geladen macromoleculen aangetrokken worden naar één van de twee
elektrodes.
