3. Bespreek zonesedimentatie
Het belangrijkste nadeel van differentiële centrifugatie is de lage resolutie door enkel de
scheiding van het snelste component en opmengen van de overige componenten. De resolutie
wordt met zonecentrifugatie verhoogd door het opbrengen van cellulaire componenten op een
verticale vloeistofkolom. De verschillende partikels zullen nu centrifugeren in banden
afhankelijk van de mobiliteit van elk partikel. Door het aanleggen van een zwakke
densiteitsgradiënt, waarvan de dichtheid stijgt richting de bodem, zullen de banden nog minder
snel diffunderen. Dit door een stijgend flotatie- en wrijvingskracht waardoor de banden nog
meer compressie ondervinden en een discrete band ontstaat. De gradiënten hiervoor kunnen
een stappengradiënt of een lineaire gradiënt zijn en in deze gradiënten is de afgelegde afstand
evenredig met de sedimentatiecoëfficiënt, zodat deze berekend kan worden met een referentie
component. Het gebruikte gradiëntsmedium moet een hoge densiteit kunnen bereiken met een
minimale toename van viscositeit, inert zijn en geen absorptie van het licht van de gebruikte
golflengte teweeg brengen.
3. Welke mogelijkheden zijn er om viruspartikels op te zuiveren met centrifugatie en wat zijn de
moeilijkheden hiervan?
Voor de opzuivering van viruspartikels is een isopycnische ultra-centrifugatie
(dichtheidsgradiëntcentrifugatie) vereist. Deze methode heeft een zeer goede resolutie door de
mogelijkheid tot scheiden van partikels met vrijwel gelijke dichtheid. Door het aanleggen van
een gradiënt in de dichtheid van de oplossing die zich instelt tijdens de centrifugatie, zullen de
verschillende componenten migreren naar hun specifieke dichtheid. Hiervoor worden meestal
zouten van zware metalen gebruikt door hun hoge oplosbaarheid en relatief lage moleculaire
gewicht voor snelle diffusie. Een van de nadelen is echter dat een lange centrifugatie nodig is
omdat de zware zouten een lage moleculaire massa hebben. Beginnende met een homogene
oplossing zal de gradiënt zich vormen tijdens de centrifugatie en hoeft men niet van tevoren
een gradiënt aan te brengen en kunnen de te scheiden componenten gewoon toegevoegd
worden aan de gradiëntoplossing. Door diffusie en sedimentatie stelt zich een evenwicht in
waarbij de concentratie van het solvent parabolisch verandert met de afstand tot het
rotorcentrum. Het kiezen van het juiste medium is erg belangrijk. Niet-ionaire media zijn vaak
te viskeus, en ionaire media zullen soms UV absorberen of de partikels dehydreren. Het verschil
tussen zonecentrifugatie en evenwichtsdichtheid centrifugatie zit dan ook vooral in de
startsituatie. Zone: gradiënt van tevoren aangelegd. Evenwichtsdichtheid: gradiënt stelt zich in
tijdens de centrifugatie. Ook zal er bij evenwichtsdichtheid geen verdere sedimentatie meer
plaatsvinden als de partikels hun eindpunt hebben bereikt, en te lang centrifugeren kan dus
geen kwaad.
, 3. Welke structuren kan men scheiden met een isopycnische centrifugatie met CsCl ( =1,92)
met een ultracentrifuge volgens de onderstaande figuur
Vereist is dat ergens in de gradiënt de dichtheid van het medium gelijk is aan de dichtheid
van het component, zodat een evenwicht zich instelt tussen de flotatiekracht en de
centrifugatiekracht. Door dit evenwicht zullen de verschillende componenten zich verzamelen
op een bepaalde concentratie in een specifieke band. CsCl is gebruikt voor de scheiding van
macromoleculen, nucleopeptiden en virussen allemaal met ultracentrifugatie.
8.1 Bespreek de Van Deemter curve (parameters, afleidingen, etc.)
De hoogte van de platen H is een maat voor de bandverbreding σ bij chromatografie. Deze
plaathoogte kan bepaald worden met de Van Deemter curve. Er zijn 3 factoren die aan de basis
liggen van σ: Eddy diffusie(A), longitudinale diffusie(B) en massa overdracht(C). Eddy diffusie A
is een maat voor de variatie van de weglengte door de kolom. Met een toename van A is ook
een toename van σ. De longitudinale diffusie B ontstaat door diffusie in de lengterichting van de
kolom en evenredig met de lengte van de kolom en omgekeerd evenredig met de lineaire
snelheid. Longitudinale diffusie treedt ook op buiten de kolom in de componenten en dit dode
volume moet zo klein mogelijk gehouden worden. Massa overdracht ontstaat door continue
absorptie en desorptie van de monstervloeistof door de matrix. Dit effect is evenredig met de
lengte van de kolom en lineaire snelheid. De totale bandverbreding is dan:
Het belangrijkste nadeel van differentiële centrifugatie is de lage resolutie door enkel de
scheiding van het snelste component en opmengen van de overige componenten. De resolutie
wordt met zonecentrifugatie verhoogd door het opbrengen van cellulaire componenten op een
verticale vloeistofkolom. De verschillende partikels zullen nu centrifugeren in banden
afhankelijk van de mobiliteit van elk partikel. Door het aanleggen van een zwakke
densiteitsgradiënt, waarvan de dichtheid stijgt richting de bodem, zullen de banden nog minder
snel diffunderen. Dit door een stijgend flotatie- en wrijvingskracht waardoor de banden nog
meer compressie ondervinden en een discrete band ontstaat. De gradiënten hiervoor kunnen
een stappengradiënt of een lineaire gradiënt zijn en in deze gradiënten is de afgelegde afstand
evenredig met de sedimentatiecoëfficiënt, zodat deze berekend kan worden met een referentie
component. Het gebruikte gradiëntsmedium moet een hoge densiteit kunnen bereiken met een
minimale toename van viscositeit, inert zijn en geen absorptie van het licht van de gebruikte
golflengte teweeg brengen.
3. Welke mogelijkheden zijn er om viruspartikels op te zuiveren met centrifugatie en wat zijn de
moeilijkheden hiervan?
Voor de opzuivering van viruspartikels is een isopycnische ultra-centrifugatie
(dichtheidsgradiëntcentrifugatie) vereist. Deze methode heeft een zeer goede resolutie door de
mogelijkheid tot scheiden van partikels met vrijwel gelijke dichtheid. Door het aanleggen van
een gradiënt in de dichtheid van de oplossing die zich instelt tijdens de centrifugatie, zullen de
verschillende componenten migreren naar hun specifieke dichtheid. Hiervoor worden meestal
zouten van zware metalen gebruikt door hun hoge oplosbaarheid en relatief lage moleculaire
gewicht voor snelle diffusie. Een van de nadelen is echter dat een lange centrifugatie nodig is
omdat de zware zouten een lage moleculaire massa hebben. Beginnende met een homogene
oplossing zal de gradiënt zich vormen tijdens de centrifugatie en hoeft men niet van tevoren
een gradiënt aan te brengen en kunnen de te scheiden componenten gewoon toegevoegd
worden aan de gradiëntoplossing. Door diffusie en sedimentatie stelt zich een evenwicht in
waarbij de concentratie van het solvent parabolisch verandert met de afstand tot het
rotorcentrum. Het kiezen van het juiste medium is erg belangrijk. Niet-ionaire media zijn vaak
te viskeus, en ionaire media zullen soms UV absorberen of de partikels dehydreren. Het verschil
tussen zonecentrifugatie en evenwichtsdichtheid centrifugatie zit dan ook vooral in de
startsituatie. Zone: gradiënt van tevoren aangelegd. Evenwichtsdichtheid: gradiënt stelt zich in
tijdens de centrifugatie. Ook zal er bij evenwichtsdichtheid geen verdere sedimentatie meer
plaatsvinden als de partikels hun eindpunt hebben bereikt, en te lang centrifugeren kan dus
geen kwaad.
, 3. Welke structuren kan men scheiden met een isopycnische centrifugatie met CsCl ( =1,92)
met een ultracentrifuge volgens de onderstaande figuur
Vereist is dat ergens in de gradiënt de dichtheid van het medium gelijk is aan de dichtheid
van het component, zodat een evenwicht zich instelt tussen de flotatiekracht en de
centrifugatiekracht. Door dit evenwicht zullen de verschillende componenten zich verzamelen
op een bepaalde concentratie in een specifieke band. CsCl is gebruikt voor de scheiding van
macromoleculen, nucleopeptiden en virussen allemaal met ultracentrifugatie.
8.1 Bespreek de Van Deemter curve (parameters, afleidingen, etc.)
De hoogte van de platen H is een maat voor de bandverbreding σ bij chromatografie. Deze
plaathoogte kan bepaald worden met de Van Deemter curve. Er zijn 3 factoren die aan de basis
liggen van σ: Eddy diffusie(A), longitudinale diffusie(B) en massa overdracht(C). Eddy diffusie A
is een maat voor de variatie van de weglengte door de kolom. Met een toename van A is ook
een toename van σ. De longitudinale diffusie B ontstaat door diffusie in de lengterichting van de
kolom en evenredig met de lengte van de kolom en omgekeerd evenredig met de lineaire
snelheid. Longitudinale diffusie treedt ook op buiten de kolom in de componenten en dit dode
volume moet zo klein mogelijk gehouden worden. Massa overdracht ontstaat door continue
absorptie en desorptie van de monstervloeistof door de matrix. Dit effect is evenredig met de
lengte van de kolom en lineaire snelheid. De totale bandverbreding is dan:
