Gevorderde moleculaire celbiologie
Celdood:
Necrose: onopzettelijke celdood
Apoptose: geprogrammeerde celdood via caspases
Omgevingsantwoord: bepaald door het soort celdood
➢ Bv necrose: systemische cytokinestorm waardoor de immunologische homeostase verloren
gaat en je in septische shock gaat
Cel morfologie: bepalen het effect van celdood op het membraan bv inkrimpen / membraan scheuren
Kankertherapie:
Ferroptose therapie patiënt: chromatine eiwitten overexpresseren en bestuderen en zo bepalen of
patiënt gevoelig is voor therapie
Immune oncology: specifieke kankertherapie gericht per individu
➢ Nadeel: heel duur en arbeidsintensief
Planten therapie: actieve stof identificeren door via HPLC stoffen te identificeren en anti-
kankerwerking testen
• Withaferine: kan ferroptose induceren
• Mangiferine: induceert ferroptose via oxidatieve stress
• Thalassioline
Ferroptose:
= biologische roest = verouderingsmechanisme
Leververvetting: door lipidenmechanismen die sterk gevoelig zijn aan biologische roest
➢ Beïnvloed door microbioom en metabolieten
Infectieziekten:
Plantenextracten: kunnen virussequenties onderdrukken
Chronisch alert immuunsysteem: bepaalde RNA virussequenties moeilijk te onderdrukken waardoor
immuunsysteem chronisch alert en vermoeid is
Humane endogene retrovirussen: (HERV) zijn evolutionair geïntegreerd in het humaan genoom maar
kunnen ook fout tot expressie komen en chronisch alert IS geven
3D organisatie nucleus – genoom:
Nucleaire compartimentalisatie:
Evolutie:
Genetische info: de hoeveelheid genoom is enorm toegenomen sinds bacteriën
➢ Meer regulatorisch DNA/RNA
➢ Codeert voor multicellulaire ontwikkeling
Nadeel: door de grote hoeveelheid genetische info is DNA meer kwetsbaar dus oprollen
, Celkern organisatie:
Chromosoom regio’s: chromosomen niet willekeurig door
elkaar maar hebben een eigen domein
Chromosome kissing: overlap tussen sommige chromosomen voor
co-regulatie van genen op verschillende chromosomen
Transcription factories: reguleren genen op meerdere chromosomen
bv interferon en cytokine moeten samen tot expressie komen
Topologisch geassocieerde domeinen: (TAD) genomisch
gebied waarbinnen DNA meer met zichzelf associeert
= gecoreguleerde regio binnen een chromosoom
Lamina geassocieerde domeinen: (LAD) lussen aan de kern periferie
(tegen lamine) met andere dichtheid en niet tot expressie komen
bv: Hox genen enkel expressie in ontwikkeling dus in LAD domein
Facultatieve LADs: domeinen die op vraag actief kunnen zijn
bv genen betrokken bij DNA herstel → geen statisch proces
Nucleaire fluïditeit:
Compartimentalisatie: zorgt dat domeinen bij elkaar komen voor regulatie van
biochemische processen
Fase separatie: veroorzaakt door chromatineveranderingen
→ zorgt voor genoom organisatie
Reorganisatie: continue herorganisatie van fasebubbels voor de TAD en LAD
organisatie van het genoom
Chromatine distributie:
Celsignalen: als respons op signalen zal de cel bepaalde genen
silencen en andere genen expresseren
→ verplaatsing naar actieve/inactieve regio
Centrum: genexpressie activiteit = genrijke regio
Lamina: silencing = genarme regio
Euchromatine: lichte regio’s , actief
Heterochromatine: donkere regio’s , inactief
Euchromatine/heterochromatine ratio: hangt af van de
biosynthetische staat van de cel
Hepatocyt: Leukocyt:
Metabool actief Wachten op activatie
,Genoom opvouwing:
DNA opvouwing:
Dubbele helix
Beads on a string: DNA 2x rond 8 histonen gewikkeld
Nucleosoom
➢ Afstand: afstand tussen 2 nucleosomen bepaalt of regio actief /
inactief wordt
Chromatine
Gecondenseerd chromatine
Chromosoom
Chromatine epigenetica testen:
➢ Acetylgroepen: lading veranderen van de nucleosomen en zo de afstand ertussen reguleren
en zo chromatine densiteit bepalen
➢ Hydrofobiciteit: celkern vol fasetransities van viscositeit die verschillen in hydrofobe eigenschappen
3C techniek:
= chromosoom conformatie capture
Functie: identificeren chromosoomcontacten
1. DNA bindende eiwitten: op plaatsen waar lussen samenkomen vaak eiwitten aanwezig
2. Formaldehyde: zorgt voor crosslinking van eiwitten aan DNA
3. Restrictie enzym: knipt het DNA in fragmenten en lussen houden sticky ends over
4. DNA ligatie: ligeert de sticky ends aan elkaar
5. Verhitting: + proteolyse om eiwit en crosslinks te verwijderen
6. PCR
Resultaat: enkel een DNA product bekomen als de DNA sequenties bij elkaar gehouden worden door
een DNA-bindend eiwit
→ Zien van waar de fragmenten komen om de chromosome kissing te bekijken
Grafieken:
Intrachromosomale bindingen: meeste fragmenten zullen binnen het chromosoom binden
Interchromosomale bindingen: ook bindingen tussen verschillende chromosomen
(oranje regio’s buiten de rechte)
High fidelity conformation capture (HI-C): alle fragmenten immunoprecipiteren met biotine tag en dan
3C techniek met next generation sequencing → contacten bekijken tussen chromosoom fragmenten
TAD = driehoek: bekijken welke enhancers contact maken
4C: 3D methode toegepast op interacties specifieke genomische regio met andere delen van genoom
bv enhancer
, HI-C technologie:
Ziekten: met HI-C vaststellen dat TAD domeinen niet
correct zijn gevormd (geen mutatie zichtbaar)
→ zorgt voor foute genexpressie
TAD/LAD:
TAD: bakent chromosoom transcriptie domein af
LAD: regelen heterochromatine lusopvouwing
Progeria: verouderingsziekte veroorzaakt door laminemutaties
Mutatie: puntmutatie in lamine A gen waardoor cryptische splice site ontwikkeld
→ splicing van 50AZ van exon 11 en vorming toxisch getrunceerd lamine A
Lamine A: zorgt voor rimpeling van de nucleaire membraan waardoor LAD domeinen los komen
→ DNA vatbaarder voor schade
DNA schade = sneller verouderen
Normaal: bij iedereen gebeurt lamine splicing wel eens fout maar niet constitutief zoals bij progeria
Mechanische stress:
Effect mechanische stress: druk uitgeoefend het cytoskelet (microtubuli)
➢ Lamines: intermediare filamenten die stevigheid geven aan membraan en verbonden zijn met
microtubuli via crosslinking / motoreiwitten
➢ LAD domeinen: verbonden met de nucleaire membraan dus mechanische stress zorg voor
herorganisatie LAD domeinen
= celsignalisatie
Celadhesie:
Weefsel structuur:
Epitheel
Lamina basalis
Bindweefsel: collageenvezels , fibroblasten , …
Celdood:
Necrose: onopzettelijke celdood
Apoptose: geprogrammeerde celdood via caspases
Omgevingsantwoord: bepaald door het soort celdood
➢ Bv necrose: systemische cytokinestorm waardoor de immunologische homeostase verloren
gaat en je in septische shock gaat
Cel morfologie: bepalen het effect van celdood op het membraan bv inkrimpen / membraan scheuren
Kankertherapie:
Ferroptose therapie patiënt: chromatine eiwitten overexpresseren en bestuderen en zo bepalen of
patiënt gevoelig is voor therapie
Immune oncology: specifieke kankertherapie gericht per individu
➢ Nadeel: heel duur en arbeidsintensief
Planten therapie: actieve stof identificeren door via HPLC stoffen te identificeren en anti-
kankerwerking testen
• Withaferine: kan ferroptose induceren
• Mangiferine: induceert ferroptose via oxidatieve stress
• Thalassioline
Ferroptose:
= biologische roest = verouderingsmechanisme
Leververvetting: door lipidenmechanismen die sterk gevoelig zijn aan biologische roest
➢ Beïnvloed door microbioom en metabolieten
Infectieziekten:
Plantenextracten: kunnen virussequenties onderdrukken
Chronisch alert immuunsysteem: bepaalde RNA virussequenties moeilijk te onderdrukken waardoor
immuunsysteem chronisch alert en vermoeid is
Humane endogene retrovirussen: (HERV) zijn evolutionair geïntegreerd in het humaan genoom maar
kunnen ook fout tot expressie komen en chronisch alert IS geven
3D organisatie nucleus – genoom:
Nucleaire compartimentalisatie:
Evolutie:
Genetische info: de hoeveelheid genoom is enorm toegenomen sinds bacteriën
➢ Meer regulatorisch DNA/RNA
➢ Codeert voor multicellulaire ontwikkeling
Nadeel: door de grote hoeveelheid genetische info is DNA meer kwetsbaar dus oprollen
, Celkern organisatie:
Chromosoom regio’s: chromosomen niet willekeurig door
elkaar maar hebben een eigen domein
Chromosome kissing: overlap tussen sommige chromosomen voor
co-regulatie van genen op verschillende chromosomen
Transcription factories: reguleren genen op meerdere chromosomen
bv interferon en cytokine moeten samen tot expressie komen
Topologisch geassocieerde domeinen: (TAD) genomisch
gebied waarbinnen DNA meer met zichzelf associeert
= gecoreguleerde regio binnen een chromosoom
Lamina geassocieerde domeinen: (LAD) lussen aan de kern periferie
(tegen lamine) met andere dichtheid en niet tot expressie komen
bv: Hox genen enkel expressie in ontwikkeling dus in LAD domein
Facultatieve LADs: domeinen die op vraag actief kunnen zijn
bv genen betrokken bij DNA herstel → geen statisch proces
Nucleaire fluïditeit:
Compartimentalisatie: zorgt dat domeinen bij elkaar komen voor regulatie van
biochemische processen
Fase separatie: veroorzaakt door chromatineveranderingen
→ zorgt voor genoom organisatie
Reorganisatie: continue herorganisatie van fasebubbels voor de TAD en LAD
organisatie van het genoom
Chromatine distributie:
Celsignalen: als respons op signalen zal de cel bepaalde genen
silencen en andere genen expresseren
→ verplaatsing naar actieve/inactieve regio
Centrum: genexpressie activiteit = genrijke regio
Lamina: silencing = genarme regio
Euchromatine: lichte regio’s , actief
Heterochromatine: donkere regio’s , inactief
Euchromatine/heterochromatine ratio: hangt af van de
biosynthetische staat van de cel
Hepatocyt: Leukocyt:
Metabool actief Wachten op activatie
,Genoom opvouwing:
DNA opvouwing:
Dubbele helix
Beads on a string: DNA 2x rond 8 histonen gewikkeld
Nucleosoom
➢ Afstand: afstand tussen 2 nucleosomen bepaalt of regio actief /
inactief wordt
Chromatine
Gecondenseerd chromatine
Chromosoom
Chromatine epigenetica testen:
➢ Acetylgroepen: lading veranderen van de nucleosomen en zo de afstand ertussen reguleren
en zo chromatine densiteit bepalen
➢ Hydrofobiciteit: celkern vol fasetransities van viscositeit die verschillen in hydrofobe eigenschappen
3C techniek:
= chromosoom conformatie capture
Functie: identificeren chromosoomcontacten
1. DNA bindende eiwitten: op plaatsen waar lussen samenkomen vaak eiwitten aanwezig
2. Formaldehyde: zorgt voor crosslinking van eiwitten aan DNA
3. Restrictie enzym: knipt het DNA in fragmenten en lussen houden sticky ends over
4. DNA ligatie: ligeert de sticky ends aan elkaar
5. Verhitting: + proteolyse om eiwit en crosslinks te verwijderen
6. PCR
Resultaat: enkel een DNA product bekomen als de DNA sequenties bij elkaar gehouden worden door
een DNA-bindend eiwit
→ Zien van waar de fragmenten komen om de chromosome kissing te bekijken
Grafieken:
Intrachromosomale bindingen: meeste fragmenten zullen binnen het chromosoom binden
Interchromosomale bindingen: ook bindingen tussen verschillende chromosomen
(oranje regio’s buiten de rechte)
High fidelity conformation capture (HI-C): alle fragmenten immunoprecipiteren met biotine tag en dan
3C techniek met next generation sequencing → contacten bekijken tussen chromosoom fragmenten
TAD = driehoek: bekijken welke enhancers contact maken
4C: 3D methode toegepast op interacties specifieke genomische regio met andere delen van genoom
bv enhancer
, HI-C technologie:
Ziekten: met HI-C vaststellen dat TAD domeinen niet
correct zijn gevormd (geen mutatie zichtbaar)
→ zorgt voor foute genexpressie
TAD/LAD:
TAD: bakent chromosoom transcriptie domein af
LAD: regelen heterochromatine lusopvouwing
Progeria: verouderingsziekte veroorzaakt door laminemutaties
Mutatie: puntmutatie in lamine A gen waardoor cryptische splice site ontwikkeld
→ splicing van 50AZ van exon 11 en vorming toxisch getrunceerd lamine A
Lamine A: zorgt voor rimpeling van de nucleaire membraan waardoor LAD domeinen los komen
→ DNA vatbaarder voor schade
DNA schade = sneller verouderen
Normaal: bij iedereen gebeurt lamine splicing wel eens fout maar niet constitutief zoals bij progeria
Mechanische stress:
Effect mechanische stress: druk uitgeoefend het cytoskelet (microtubuli)
➢ Lamines: intermediare filamenten die stevigheid geven aan membraan en verbonden zijn met
microtubuli via crosslinking / motoreiwitten
➢ LAD domeinen: verbonden met de nucleaire membraan dus mechanische stress zorg voor
herorganisatie LAD domeinen
= celsignalisatie
Celadhesie:
Weefsel structuur:
Epitheel
Lamina basalis
Bindweefsel: collageenvezels , fibroblasten , …
