Analytische biochemie I
1. Inleiding
1.1. Algemene inleiding
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met als doel het begrijpen van
het moleculaire werkingsmechanisme van de cel
Voorbeelden:
❥ De pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van moleculen in een levend
organismen en de mechanismen verantwoordelijk voor fouten in deze pathways.
❥ De structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen van deze molecule in een levend
organisme.
❥ De energetica van biologische processen zoals transport over celmembraan, productie van
cellulaire energie, energie omzettingen en uitwisseling van energie tussen verschillende cel
compartimenten en/of met het extracellulaire milieu.
1.2. Design van een biochemisch experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9 Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
10 Formulering van nieuwe hypothesen en toekomstige experimenten die voortvloeien uit de
studie
① Identificatie van het onderwerp
1 Identificatie van het onderwerp
❥ Wat willen we onderzoeken?
❥ Geen brede, algemene vragen stellen, indien wel, deze opsplitten in specifieke deelvragen met elk
een specifiek doel
❥ Bv.: onderzoek naar een nieuwe mutatie in het ADNP proteïne
② Literatuur
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
❥ Wat is er al geweten over dit onderwerp/over de methodes?
❥ Heeft iemand al hetzelfde of een soortgelijk experiment uitgevoerd?
Pagina 1 van 75
,Analytische biochemie I
③ Formulering van vraagstelling of hypothese
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
❥ Welke hypothese willen we stellen en wat is de vraagstelling?
❥ Bv.: heeft de gevonden mutatie een effect op de lengte van het ADNP eiwit?
④ Selectie van biologisch systeem
❥ Welk biologisch systeem gaan we gebruiken; species, in vivo of in vitro?
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
❥ Bv.: humaan zenuwweefsel van de patiënt (met de mutatie)
⑤ Identificatie van de variabele en controle van de omgevingsparameters
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
❥ Welke variabele bestuderen we?
❥ Hoe zorgen we ervoor dat alle andere parameters stabiel blijven en dat de gekozen variabele de
enige is die de uitkomst van het experiment bepaalt?
❥ Zijn er andere variabele buiten degene die we willen bestuderen?
❥ Bv.: te bestuderen variabele: moleculair gewicht (i.e. lengte) van het eiwit
❥ Andere zaken om mee rekening te houden: lading van het eiwit, andere contaminerende
eiwitten/biomoleculen (moleculen die niet van interesse zijn), hoeveelheid van het staal
beschikbaar
Pagina 2 van 75
,Analytische biochemie I
⑥ Design van het experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
❥ Welke materiaal/apparatuur hebben we en welke moeten we gebruiken van andere
onderzoeksgroepen?
❥ Welke kalibraties en controles hebben we nodig (om aspecifieke signalen of artefacten te
vermijden)?
❥ Kostprijs van het experiment
❥ Eventuele veiligheidsvoorschriften, ethische dossiers (in vivo), vergunningen, trainingen?
⑦ Uitvoering van het experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
❥ Het experiment moet nauwkeurig worden uitgevoerd zodanig dat het reproduceerbaar is
❥ Men moet kritisch zijn op uitvoeringen en handelingen; heb ik wel correct gewerkt of ergens een
fout gemaakt?
❥ Telkens notities nemen doorheen het proces!
❥ Positieve, negatieve en eventueel andere controles toepassen
❥ Bv.: 1 staal waar wild-type ADNP in zit en 1 staal waar geen ADNP in zit
Pagina 3 van 75
, Analytische biochemie I
⑧ Analyse van de resultaten
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
❥ Kritisch zijn op bekomen resultaten en eventueel statistische testen uitvoeren (d.m.v
beslissingsboom)
⑨ Formulering van de belangrijkste conclusies
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9 Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
❥ Moet het experiment worden herhaald of zijn er extra experimenten nodig?
❥ Zijn mijn resultaten een antwoord op de onderzoeksvraag en hypothese?
Pagina 4 van 75
1. Inleiding
1.1. Algemene inleiding
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met als doel het begrijpen van
het moleculaire werkingsmechanisme van de cel
Voorbeelden:
❥ De pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van moleculen in een levend
organismen en de mechanismen verantwoordelijk voor fouten in deze pathways.
❥ De structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen van deze molecule in een levend
organisme.
❥ De energetica van biologische processen zoals transport over celmembraan, productie van
cellulaire energie, energie omzettingen en uitwisseling van energie tussen verschillende cel
compartimenten en/of met het extracellulaire milieu.
1.2. Design van een biochemisch experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9 Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
10 Formulering van nieuwe hypothesen en toekomstige experimenten die voortvloeien uit de
studie
① Identificatie van het onderwerp
1 Identificatie van het onderwerp
❥ Wat willen we onderzoeken?
❥ Geen brede, algemene vragen stellen, indien wel, deze opsplitten in specifieke deelvragen met elk
een specifiek doel
❥ Bv.: onderzoek naar een nieuwe mutatie in het ADNP proteïne
② Literatuur
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
❥ Wat is er al geweten over dit onderwerp/over de methodes?
❥ Heeft iemand al hetzelfde of een soortgelijk experiment uitgevoerd?
Pagina 1 van 75
,Analytische biochemie I
③ Formulering van vraagstelling of hypothese
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
❥ Welke hypothese willen we stellen en wat is de vraagstelling?
❥ Bv.: heeft de gevonden mutatie een effect op de lengte van het ADNP eiwit?
④ Selectie van biologisch systeem
❥ Welk biologisch systeem gaan we gebruiken; species, in vivo of in vitro?
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
❥ Bv.: humaan zenuwweefsel van de patiënt (met de mutatie)
⑤ Identificatie van de variabele en controle van de omgevingsparameters
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
❥ Welke variabele bestuderen we?
❥ Hoe zorgen we ervoor dat alle andere parameters stabiel blijven en dat de gekozen variabele de
enige is die de uitkomst van het experiment bepaalt?
❥ Zijn er andere variabele buiten degene die we willen bestuderen?
❥ Bv.: te bestuderen variabele: moleculair gewicht (i.e. lengte) van het eiwit
❥ Andere zaken om mee rekening te houden: lading van het eiwit, andere contaminerende
eiwitten/biomoleculen (moleculen die niet van interesse zijn), hoeveelheid van het staal
beschikbaar
Pagina 2 van 75
,Analytische biochemie I
⑥ Design van het experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
❥ Welke materiaal/apparatuur hebben we en welke moeten we gebruiken van andere
onderzoeksgroepen?
❥ Welke kalibraties en controles hebben we nodig (om aspecifieke signalen of artefacten te
vermijden)?
❥ Kostprijs van het experiment
❥ Eventuele veiligheidsvoorschriften, ethische dossiers (in vivo), vergunningen, trainingen?
⑦ Uitvoering van het experiment
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
❥ Het experiment moet nauwkeurig worden uitgevoerd zodanig dat het reproduceerbaar is
❥ Men moet kritisch zijn op uitvoeringen en handelingen; heb ik wel correct gewerkt of ergens een
fout gemaakt?
❥ Telkens notities nemen doorheen het proces!
❥ Positieve, negatieve en eventueel andere controles toepassen
❥ Bv.: 1 staal waar wild-type ADNP in zit en 1 staal waar geen ADNP in zit
Pagina 3 van 75
, Analytische biochemie I
⑧ Analyse van de resultaten
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
❥ Kritisch zijn op bekomen resultaten en eventueel statistische testen uitvoeren (d.m.v
beslissingsboom)
⑨ Formulering van de belangrijkste conclusies
1 Identificatie van het onderwerp
2 Literatuur: sterktes/zwaktes van reeds gebruikte methodologieën en vooropgestelde
hypothesen
3 Formulering van vraagstelling of hypothese waarvoor het experiment gepland werd
4 Selectie van het biologisch systeem (species, in vitro of in vivo)
5 Identificatie van de variabele die bestudeerd wordt alsook controle v/d omgevingsparameters
6 Design v/h experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
7 Uitvoering van het experiment met inbegrip van passende kalibraties en controles
8 Analyse van de resultaten, eventueel met gebruik van statistische testen
9 Formulering van de belangrijkste conclusies die uit de resultaten kunnen getrokken worden
❥ Moet het experiment worden herhaald of zijn er extra experimenten nodig?
❥ Zijn mijn resultaten een antwoord op de onderzoeksvraag en hypothese?
Pagina 4 van 75
