Celculturen
Geschiedenis:
1907 1949 1950 1951 1953 1957 1975
• Eerste dierlijke • Kweek van • Ontdekking • HELA cells • Geïnactiveerd • Levend • Hybridoma-
celcultuur polio in antibiotica polio vaccin verzwakt polio technologie
humane cellen • Trypsine vaccin
• Chemisch
gedefinieerde
cultuurmedia
Geïnactiveerd polio vaccin: polio virus wordt geïnactiveerd door het toevoegen van formaline
Levend verzwakt polio vaccin: virus wordt gekweekt cultuur → worden overgeplaatst naar nieuwe
flessen → één van de flessen gaat een verzwakte mutant dat enkel nog kan leven in de ideale
omgeving van het labo
HELA cells: Henriette Lacks had baarmoederhalskanker door HPV → cellen nog gebruikt in onderzoek
Hybridoma-technologie:
1. Normale B-cel fusioneert met een tumorale cel
2. Een continue B-cel wordt gevormd die eeuwig antilichamen kan maken
3. Juiste B-cellen worden geselecteerd door de bindingsplaats voor enkel die specifieke
antilichamen te voorzien
4. Plaat spoelen zodat je enkel het nodige hybridoma overhoudt en de nodige antilichamen krijgt
→ productie van monoklonale antilichamen
Cel- en weefseltechnologie: implantaten , skingrafts , insuline voorzien via scaffolds in patiënt
Cel- en weefselculturen:
Voordelen:
Controle van de omgeving:
➢ Fysiochemische parameters (pH , temperatuur , osmotische druk , O2 , CO2)
➢ Fysiologische parameters (voedingsstoffen , serum)
Karakterisatie en homogeniteit:
➢ Celcultuur is homogeen
→ heterogene cultuur wordt homogeen door mengen van cellen + selectie van 1 celtype
onder bepaalde cultuuromstandigheden
➢ Wel cyrostock maken
Cryostock: een fles cellen dat bewaard wordt en wanneer cellen op zijn deze laten groeien en
terug subcultiveren voor nieuwe cellen
Kostprijs:
➢ Miniaturisatie: je kan het onderzoek doen met kleine hoeveelheden monster en reagentia
➢ Proefdieren zijn duurder
Ethiek:
➢ Leed van proefdieren vermijden
,Beperkingen:
Expertise:
➢ Je moet steriel/aseptisch werken zodat je cultuur niet besmet wordt
➢ Bij besmetting groeien bacterïen, schimmels,… sneller dan de cellen
Hoeveelheid:
➢ Laboschaal is te weinig voor het representeren van de gewichten (is maar tot gram)
➢ Op industriële schaal werken is duur
Instabiliteit:
➢ Normale cellen hebben een beperkte levensduur (senescentie = ouder worden van cellen)
➢ Continue cellen hebben een aneuploïde aantal chromosomen
Cultuuromgeving VS in vivo:
Tweedimensioneel:
➢ Cel-cel en cel-matrix interacties ontbreken
➢ Cellen zijn beweeglijk in cultuur
➢ Snellere en meer deling in cultuur doordat ze onder de ideale omstandigheden leven
→ in vivo zijn cellen meer ingepakt dus minder toegang tot groeifactoren
➢ Er blijven slechts 1 of 2 celtypen over
→ geen heterotypisch cel-celinteracties
Oversimplificatie van het cultuurmedium:
➢ Verbindingen voor homeostatische regeling ontbreken (zenuwstelsel, endocriene organen)
Cellulair metabolisme is meer constant:
➢ Energiemetabolisme meer gebaseerd op glycolyse (constanter) , minder gebaseerd op de
citroenzuurcyclus zoals in vivo
Definities:
Orgaanculturen:
➢ Gemaakt uit embryonale organen of uit weefselfragmenten van organen
Voordelen: driedimensionale weefselstructuur en cellulaire interacties behouden
Nadelen: orgaanculturen kunnen niet delen dus telkens vers weefsel nodig +
geen reproduceerbaarheid want geen 2 placenta’s zijn gelijk
Bv: placenta wordt op haar plaats gehouden door fibrine waardoor cellen kunnen
vasthechten aan de bodem → bloedvaten groeien uit de placenta = angiogenese
Explant culturen:
➢ Gemaakt door weefsels rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme
bv huidbiopt, spierbiopt, tumorweefsels
Cultuur verkrijgen:
➢ Chirurgisch uitsnijden → grote hoeveelheid weefsel
➢ Naaldbiopsie → minder invasief + sneller
Voordelen: cel-cel en cel-matrix interacties behouden + gemakkelijk manipuleerbaar
Nadelen: cultuur is beperkt houdbaar + cellen kunnen de-differentiëren en hun functie verliezen
bv spiercel in vitro kan niet meer contraheren
, Primaire culturen:
➢ Gemaakt door cellen rechtstreeks uit weefsel te halen
➢ Meestal heterogene mix van cellen na extractie uit weefsel = cocultuur
Voordeel = Cocultuur: heeft nog cel-cel interacties + ene celtype kan factoren(stollings- / groeifactoren)
uitscheiden met invloed op het andere type = paracrien effect
Nadeel: is instabiel omdat de samenstelling van de primaire cultuur verandert in de tijd
➢ Door senescentie
➢ Door de-differentiatie
➢ Doordat 1 celtype een groeivoordeel heeft en sneller groeit dus plaats inneemt van andere cellen
Eindige culturen: normale cellen
➢ Is een primaire celcultuur nadat het gesubcultiveerd is
Beperkt aantal delingen: door senescentie is het maximaal aantal delingen 60 keer = Hayflick limiet
➢ Door verkorting van telomeren bij elke celdeling
Geïmmortaliseerde cellijnen: continue cellijn ,
➢ Door mutaties in normale cellen waardoor ze niet meer verouderen
Ontstaan:
• In vivo (kankercellen)
• Spontaan optreden bij primaire cultuur
• Geïnduceerd door transformatie (bestralen , virus dat mutaties/kanker veroorzaakt ,
mutagene stof toevoegen)
Groei: vormen een monolaag / groeien in suspensie(sneller) als ze geen adhaesie nodig hebben
Organotypische culturen:
➢ Verschillende celtypes bij elkaar in cultuur om 3D-structuur te creëren
Bv: gebruiken van een filter-Well insert
➔ model voor cellulaire interacties
Dissociatie cultuur: weefsel in
trypsine om aparte cellen te krijgen
Orgaancultuur Explantcultuur Celcultuur
Bron Embryonale organen , Weefselfragmenten Dissociatiecultuur ,
weefselfragmenten eindige cellijn
Inspanning Makkelijk Matig Laag
Propagatie Niet mogelijk Mogelijk door uitgroei Standaardprocedures
= verder kweken van cellen van cellen
Reproduceerbaarheid Veel variatie Veel variatie Weinig variatie
Kwantificatie Moeilijk Moeilijk Gemakkelijk
, Evolutie van een cellijn:
y-as: totale aantal cellen , x-as: weken in cultuur
0 weken: cellen losmaken met trypsine en in cultuur
brengen
→ kleine daling in cellen doordat enkele cellen
afsterven (trypsine breekt eiwitverbindingen)
Geel: geen lineaire groeisnelheid doordat niet alle
cellen even snel groeien en er na bepaalde tijd blijft
er 1 celtype over
Rood: cellen worden gesubcultiveerd / gepasseerd
Blauw: cellijn bekomen waarbij de cellen groeien aan
dezelfde groeisnelheid
* : op dit moment cellen in cyrostock zetten
Groen: cellen worden oud en beginnen te sterven
(senescentie)
Transformatie: door de cellen continu te maken
sterven ze niet af
Grafiek na cryostock:
• Normale cellen: curve is hetzelfde zonder geel stuk van celdood door trypsine
• Continue cellen: grafiek is een rechte omdat er geen celdood is
Trypsine: soort protease (=enzym dat eiwitten kan splitsen) waardoor de eiwitbindingen tussen cellen
in weefsel breken en losse cellen bekomt
➢ Trypsine bij cellen in weefsel: cellen aan de buitenkant zijn langer blootgesteld aan trypsine
tegen dat de cellen vanbinnen los zijn gekomen dus celdood aan de buitenkant
➢ Trypsine bij passage: alle cellen zijn even lang blootgesteld dus geen celdood
Celcultuur maken:
1. Cellen migreren uit weefsels:
1. Breng weefsel in petriplaat en was met PBS (= fosfaat gebufferde salineoplossing/ zoutoplossing)
→ cellen overleven daarin
2. Snijdt weefsel in stukjes van 1mm²
3. Breng 25 stukjes van 1mm² in een 25cm² fles(oppervlakte = 25cm²)
4. Breng cultuurmedium en serum van 40% in de fles
→ 40% serum zodat cellen beter kunnen groeien en vasthechten
5. Incubeer overnacht
6. Weefselstukjes zijn aangehecht en je doet medium weg
7. Nieuw medium aanbrengen met lager % serum
Voordelen: meeste cellen kunnen migreren + nuttig bij kleine hoeveelheid weefsel
Nadelen: sommige cellen kunnen slecht aanhechten (slechte adhaesie) + meestal groeien enkel
buitenste cellen uit
bv Explant cultuur is handig als je cellen nodig aan de buitenkant van een klein stuk weefsel
Geschiedenis:
1907 1949 1950 1951 1953 1957 1975
• Eerste dierlijke • Kweek van • Ontdekking • HELA cells • Geïnactiveerd • Levend • Hybridoma-
celcultuur polio in antibiotica polio vaccin verzwakt polio technologie
humane cellen • Trypsine vaccin
• Chemisch
gedefinieerde
cultuurmedia
Geïnactiveerd polio vaccin: polio virus wordt geïnactiveerd door het toevoegen van formaline
Levend verzwakt polio vaccin: virus wordt gekweekt cultuur → worden overgeplaatst naar nieuwe
flessen → één van de flessen gaat een verzwakte mutant dat enkel nog kan leven in de ideale
omgeving van het labo
HELA cells: Henriette Lacks had baarmoederhalskanker door HPV → cellen nog gebruikt in onderzoek
Hybridoma-technologie:
1. Normale B-cel fusioneert met een tumorale cel
2. Een continue B-cel wordt gevormd die eeuwig antilichamen kan maken
3. Juiste B-cellen worden geselecteerd door de bindingsplaats voor enkel die specifieke
antilichamen te voorzien
4. Plaat spoelen zodat je enkel het nodige hybridoma overhoudt en de nodige antilichamen krijgt
→ productie van monoklonale antilichamen
Cel- en weefseltechnologie: implantaten , skingrafts , insuline voorzien via scaffolds in patiënt
Cel- en weefselculturen:
Voordelen:
Controle van de omgeving:
➢ Fysiochemische parameters (pH , temperatuur , osmotische druk , O2 , CO2)
➢ Fysiologische parameters (voedingsstoffen , serum)
Karakterisatie en homogeniteit:
➢ Celcultuur is homogeen
→ heterogene cultuur wordt homogeen door mengen van cellen + selectie van 1 celtype
onder bepaalde cultuuromstandigheden
➢ Wel cyrostock maken
Cryostock: een fles cellen dat bewaard wordt en wanneer cellen op zijn deze laten groeien en
terug subcultiveren voor nieuwe cellen
Kostprijs:
➢ Miniaturisatie: je kan het onderzoek doen met kleine hoeveelheden monster en reagentia
➢ Proefdieren zijn duurder
Ethiek:
➢ Leed van proefdieren vermijden
,Beperkingen:
Expertise:
➢ Je moet steriel/aseptisch werken zodat je cultuur niet besmet wordt
➢ Bij besmetting groeien bacterïen, schimmels,… sneller dan de cellen
Hoeveelheid:
➢ Laboschaal is te weinig voor het representeren van de gewichten (is maar tot gram)
➢ Op industriële schaal werken is duur
Instabiliteit:
➢ Normale cellen hebben een beperkte levensduur (senescentie = ouder worden van cellen)
➢ Continue cellen hebben een aneuploïde aantal chromosomen
Cultuuromgeving VS in vivo:
Tweedimensioneel:
➢ Cel-cel en cel-matrix interacties ontbreken
➢ Cellen zijn beweeglijk in cultuur
➢ Snellere en meer deling in cultuur doordat ze onder de ideale omstandigheden leven
→ in vivo zijn cellen meer ingepakt dus minder toegang tot groeifactoren
➢ Er blijven slechts 1 of 2 celtypen over
→ geen heterotypisch cel-celinteracties
Oversimplificatie van het cultuurmedium:
➢ Verbindingen voor homeostatische regeling ontbreken (zenuwstelsel, endocriene organen)
Cellulair metabolisme is meer constant:
➢ Energiemetabolisme meer gebaseerd op glycolyse (constanter) , minder gebaseerd op de
citroenzuurcyclus zoals in vivo
Definities:
Orgaanculturen:
➢ Gemaakt uit embryonale organen of uit weefselfragmenten van organen
Voordelen: driedimensionale weefselstructuur en cellulaire interacties behouden
Nadelen: orgaanculturen kunnen niet delen dus telkens vers weefsel nodig +
geen reproduceerbaarheid want geen 2 placenta’s zijn gelijk
Bv: placenta wordt op haar plaats gehouden door fibrine waardoor cellen kunnen
vasthechten aan de bodem → bloedvaten groeien uit de placenta = angiogenese
Explant culturen:
➢ Gemaakt door weefsels rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme
bv huidbiopt, spierbiopt, tumorweefsels
Cultuur verkrijgen:
➢ Chirurgisch uitsnijden → grote hoeveelheid weefsel
➢ Naaldbiopsie → minder invasief + sneller
Voordelen: cel-cel en cel-matrix interacties behouden + gemakkelijk manipuleerbaar
Nadelen: cultuur is beperkt houdbaar + cellen kunnen de-differentiëren en hun functie verliezen
bv spiercel in vitro kan niet meer contraheren
, Primaire culturen:
➢ Gemaakt door cellen rechtstreeks uit weefsel te halen
➢ Meestal heterogene mix van cellen na extractie uit weefsel = cocultuur
Voordeel = Cocultuur: heeft nog cel-cel interacties + ene celtype kan factoren(stollings- / groeifactoren)
uitscheiden met invloed op het andere type = paracrien effect
Nadeel: is instabiel omdat de samenstelling van de primaire cultuur verandert in de tijd
➢ Door senescentie
➢ Door de-differentiatie
➢ Doordat 1 celtype een groeivoordeel heeft en sneller groeit dus plaats inneemt van andere cellen
Eindige culturen: normale cellen
➢ Is een primaire celcultuur nadat het gesubcultiveerd is
Beperkt aantal delingen: door senescentie is het maximaal aantal delingen 60 keer = Hayflick limiet
➢ Door verkorting van telomeren bij elke celdeling
Geïmmortaliseerde cellijnen: continue cellijn ,
➢ Door mutaties in normale cellen waardoor ze niet meer verouderen
Ontstaan:
• In vivo (kankercellen)
• Spontaan optreden bij primaire cultuur
• Geïnduceerd door transformatie (bestralen , virus dat mutaties/kanker veroorzaakt ,
mutagene stof toevoegen)
Groei: vormen een monolaag / groeien in suspensie(sneller) als ze geen adhaesie nodig hebben
Organotypische culturen:
➢ Verschillende celtypes bij elkaar in cultuur om 3D-structuur te creëren
Bv: gebruiken van een filter-Well insert
➔ model voor cellulaire interacties
Dissociatie cultuur: weefsel in
trypsine om aparte cellen te krijgen
Orgaancultuur Explantcultuur Celcultuur
Bron Embryonale organen , Weefselfragmenten Dissociatiecultuur ,
weefselfragmenten eindige cellijn
Inspanning Makkelijk Matig Laag
Propagatie Niet mogelijk Mogelijk door uitgroei Standaardprocedures
= verder kweken van cellen van cellen
Reproduceerbaarheid Veel variatie Veel variatie Weinig variatie
Kwantificatie Moeilijk Moeilijk Gemakkelijk
, Evolutie van een cellijn:
y-as: totale aantal cellen , x-as: weken in cultuur
0 weken: cellen losmaken met trypsine en in cultuur
brengen
→ kleine daling in cellen doordat enkele cellen
afsterven (trypsine breekt eiwitverbindingen)
Geel: geen lineaire groeisnelheid doordat niet alle
cellen even snel groeien en er na bepaalde tijd blijft
er 1 celtype over
Rood: cellen worden gesubcultiveerd / gepasseerd
Blauw: cellijn bekomen waarbij de cellen groeien aan
dezelfde groeisnelheid
* : op dit moment cellen in cyrostock zetten
Groen: cellen worden oud en beginnen te sterven
(senescentie)
Transformatie: door de cellen continu te maken
sterven ze niet af
Grafiek na cryostock:
• Normale cellen: curve is hetzelfde zonder geel stuk van celdood door trypsine
• Continue cellen: grafiek is een rechte omdat er geen celdood is
Trypsine: soort protease (=enzym dat eiwitten kan splitsen) waardoor de eiwitbindingen tussen cellen
in weefsel breken en losse cellen bekomt
➢ Trypsine bij cellen in weefsel: cellen aan de buitenkant zijn langer blootgesteld aan trypsine
tegen dat de cellen vanbinnen los zijn gekomen dus celdood aan de buitenkant
➢ Trypsine bij passage: alle cellen zijn even lang blootgesteld dus geen celdood
Celcultuur maken:
1. Cellen migreren uit weefsels:
1. Breng weefsel in petriplaat en was met PBS (= fosfaat gebufferde salineoplossing/ zoutoplossing)
→ cellen overleven daarin
2. Snijdt weefsel in stukjes van 1mm²
3. Breng 25 stukjes van 1mm² in een 25cm² fles(oppervlakte = 25cm²)
4. Breng cultuurmedium en serum van 40% in de fles
→ 40% serum zodat cellen beter kunnen groeien en vasthechten
5. Incubeer overnacht
6. Weefselstukjes zijn aangehecht en je doet medium weg
7. Nieuw medium aanbrengen met lager % serum
Voordelen: meeste cellen kunnen migreren + nuttig bij kleine hoeveelheid weefsel
Nadelen: sommige cellen kunnen slecht aanhechten (slechte adhaesie) + meestal groeien enkel
buitenste cellen uit
bv Explant cultuur is handig als je cellen nodig aan de buitenkant van een klein stuk weefsel
