Hoofdstuk 1: Inleiding
1.1 Geschiedenis
• Oorsprong 1907 (Ross Harrison)
• Doorbraak rond 1950
o Antibiotica (voorkomen besmettingen)
o Trypsine (cellen losmaken)
o Chemisch gedefinieerde cultuurmedia
• Exponentiële toename na 1970
• Poliovirus
o 1949 (Enders): kweek in menselijke embryonale cellen
o 1953 (Salk): formaline geïnactiveerd poliovaccin
o 1957 (Sabin): levend verzwakt poliovaccin
• HeLa-cellijn
o 1951: Henriette Lacks overleden: baarmoederhalskanker --> kankeronderzoek
• Hybridoma-technologie
o 1975: Köhler & Milstein --> productie van monoklonale antilichamen
o Hybrydoma: cel die ontstaat door fusie van B-lymfocyt & kankercel
• Cel- en weefseltechnologie
o (Bio)implantaten
o Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
1.2 Voordelen van cel- en weefselkweekculturen
1.2.1 Controle van de omgeving
• Fysicochemische parameters: pH, temp, osmotische druk, O2- en CO2-spanning
o 37°C, pH 7, osmotische druk is isotoon (0,9% NaCl), 21% O2 in lucht en 0,03% CO2
• Fysiologische parameters: voedingssto\en (+ % serum)
1.2.2 Goede karakterisatie en homogeniteit
• Redelijk homogeen (behalve orgaanculturen): vertrekkende van heterogene primaire cultuur:
homogeniteit van cellen neemt door subcultivatie toe
o Cellen worden bij elke transfer gemengd
o Er vindt een selectie van één bepaald celtype plaats oiv cultuuromstandigheden
• Passage --> aanmaak cryostock (anders: mutaties)
1.2.3 Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
• Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster & reagentia
• Aankoop & onderhoud proefdieren is duur + ethische vragen
1.3 Beperkingen van weefselculturen
1.3.1 Expertise
• Aseptisch werken --> tragere groei dan meeste bacteriën & schimmels
1.3.2 Hoeveelheid
• Laboschaal: max 109 cellen --> gramhoeveelheden (want 1 cel 10-9 gram)
• Industriële schaal vereist opschaling
,1.3.3 Instabiliteit
• Normale cellen: beperkte levensduur --> geleidelijk verlies van gedi\erentieerde eig. --> stoppen met
delen --> uiteindelijk sterven (senescentie)
• Continue cellen: aneuploïde aantal chromosomen
1.3.4 Cultuuromgeving (in vitro) versus in vivo
• Tweedimensionaal (in vivo: driedimensionaal)
o Cel-cel en cel-matrix interacties
o Cellen zijn beweeglijk
o Snelle celdeling
o Eén of twee celtypes blijven over --> heterotypische cel-cel interacties van weefsel verdwenen
• Oversimplificatie van het cultuurmedium
o Zenuwstelsel & endocriene organen ontbreken
• Cellulaire metabolisme is meer constant --> niet representatief
o Energiemetabolisme obv glycolyse + minder citroenzuurcyclus
Hoofdstuk 2: Cel- en weefselkweekculturen: definities --> 6
cultuurmethoden
2.1 Orgaanculturen
• Driedimensionale structuur & functie (gedeeltelijk) bewaard
• Rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme --> op vloeistof-gasinterfase gekweekt
• Kan di\erentiatie optreden van cellen
• Angiogenese
• Voordeel: cellulaire interacties
• Nadelen: telkens vers weefsel nodig & reproduceerbaarheid
2.2 Explant culturen
• Rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme
• Bv: huidbiopten, spierbiopten & tumorweefsels
• Werkwijze:
o Chirurgisch uitsnijden --> grote hoeveelheid weefsel
o Naaldbiopt --> minder invasief, sneller, minder weefsel (<1 gram)
• Contaminatie bloed verminderen --> perfusie (fysiologische zoutoplossing)
• Microdissectie met infrarood-/ultravioletlaser --> weefsel van biopt isoleren
• Voordelen
o Cel-cel & cel-matrix interacties behouden
o Makkelijk manipuleerbaar
• Nadelen
o Beperkt houdbaar
o Cellen kunnen de-di\erentiëren (verliezen gespecialiseerde functie)
2.3 Primaire culturen
• Cellen rechtstreeks afkomstig van een bepaald orgaan of weefsel
• Meestal een heterogene mix van verschillende celtypes ==> co-cultuur
• Voordelen
o Co-cultuur --> cel-cel interacties (cfr in vivo)
o Ene celtype kan factoren (groei- & stollings-) uitscheiden voor ander celtype ==> paracriene\ect
• Nadelen
, o Instabiel
o Onderlinge verhouding van celtypes verandert, cellen kunnen de-di\erentiëren en verouderen,
bepaalde celtypes hebben groeivoordeel --> samenstelling van primaire cultuur verandert
2.4 Eindige celculturen
• Na subcultivatie van primaire celcultuur
• Een beperkt aantal celdelingen na het in kweek brengen --> senescentie
o Verkorting van uiteinden van chromosomen (telomeren) na celdeling
<-> stamcellen: verhoogde expressie van telomerase
Maximum 60-tal keer deken ==> Hayflick limiet
2.5 Geïmmortaliseerde cellijnen
• Cellen die oneindig lijken te delen
• = continue cellijnen --> monolaag of celsuspensie (sneller + hoge celdensiteit)
• Ontstaan: in vivo (kankercellen), spontaan (mutaties) of geïnduceerd: transformatie
2.6 Organotypische celculturen (zie hoofdstuk gespecialiseerde systemen)
• Gedeeltelijke reassociatie om driedimensionale structuur te creëren
o Creëren van een model voor cellulaire interacties
o Geen weefselstructuur
Voor- en nadelen van verschillende cultuurmethodes
Orgaankweek
• Aanhouden of groeien van weefselfragmenten of (delen van) organen in vitro
o Mogelijkheid tot di0erentiatie
o Intacte functie
Weefselkweek
• Aanhouden of groeien van weefselfragmenten in vitro
o Weefselstructuur hoeft niet functioneel te zijn
Celkweek
• Aanhouden en groeien van cellen in vitro
o Gedissocieerd van het oorspronkelijke weefsel door spontane migratie of mechanische of
enzymatische methoden
o Geen weefselstructuur
o Cellen groeien als mono- of multilayers op substraat of in suspensie
Organotypische cultuur
• Aanhouden en groeien van meer dan 1 celtype in vitro
o Creëren van een model voor cellulaire interacties
o Geen weefselstructuur
Primaire kweek
• Cellen rechtstreeks afkomstig van een bepaald orgaan of weefsel
Eindige cellijnen
• Cellen hebben een beperkt aantal celdelingen na het in kweek brengen
, Continue cellijnen
• Cellen die oneindig lijken te delen (immortalisatie, maligne transformatie)
Categorie Orgaancultuur Explantcultuur Celcultuur
Bron Embryonale Weefselfragmenten Dissociatiecultuur,
organen, adulte eindige cellijn
weefselfragmenten
Inspanning Makkelijk Matig Laag
Karakterisering Histologie Cytologie en merkers Biochemische,
moleculaire,
immunologische en
cytologische technieken
Histologie Informatief Moeilijk Niet van toepassing
Biochemische di\erentiatie Mogelijk Heterogeen Kan geïnduceerd worden
Propagatie Niet mogelijk Mogelijk door uitgroei cellen Standaardprocedures
Reproduceerbaarheid Veel variatie Veel variatie Weinig variatie
Kwantificatie Moeilijk Moeilijk Gemakkelijk
Hoofdstuk 3: Soorten cellen en culturen
3.1 Het verkrijgen van cellen voor celkweek: cellen migreren uit weefsel
• Voordelen
o Meeste cellen migreren (vnl. embryonale cellen)
o Nuttig bij kleine hoeveelheden weefsel
• Nadelen
o Slecht adhesieve eigenschappen van sommige cellen
o Selectie op basis van uitgroei
Protocol voor het spontaal laten migreren van cellen uit het weefsel
• Breng weefsel in een steriele petrischaal & was met steriel PBS. Snijd ev. dood weefsel & vet weg.
• Breng weefsel in nieuwe petrischaal --> snijd met 2 scalpels het weefsels in stukjes van 1 mm³.
• Pipetteer 10 ml PBS op weefselstukjes, zuig samen op & pipetteer in 50 ml tube. Laat weefselstukjes
bezinken & zuig PBS opnieuw af.
• Voeg 10-20 ml PBS toe, laat bezinken & verwijder PBS. Herhaal tot PBS helder blijft.
• Pipetteer cultuurmedium op de weefselstukjes.
1.1 Geschiedenis
• Oorsprong 1907 (Ross Harrison)
• Doorbraak rond 1950
o Antibiotica (voorkomen besmettingen)
o Trypsine (cellen losmaken)
o Chemisch gedefinieerde cultuurmedia
• Exponentiële toename na 1970
• Poliovirus
o 1949 (Enders): kweek in menselijke embryonale cellen
o 1953 (Salk): formaline geïnactiveerd poliovaccin
o 1957 (Sabin): levend verzwakt poliovaccin
• HeLa-cellijn
o 1951: Henriette Lacks overleden: baarmoederhalskanker --> kankeronderzoek
• Hybridoma-technologie
o 1975: Köhler & Milstein --> productie van monoklonale antilichamen
o Hybrydoma: cel die ontstaat door fusie van B-lymfocyt & kankercel
• Cel- en weefseltechnologie
o (Bio)implantaten
o Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
1.2 Voordelen van cel- en weefselkweekculturen
1.2.1 Controle van de omgeving
• Fysicochemische parameters: pH, temp, osmotische druk, O2- en CO2-spanning
o 37°C, pH 7, osmotische druk is isotoon (0,9% NaCl), 21% O2 in lucht en 0,03% CO2
• Fysiologische parameters: voedingssto\en (+ % serum)
1.2.2 Goede karakterisatie en homogeniteit
• Redelijk homogeen (behalve orgaanculturen): vertrekkende van heterogene primaire cultuur:
homogeniteit van cellen neemt door subcultivatie toe
o Cellen worden bij elke transfer gemengd
o Er vindt een selectie van één bepaald celtype plaats oiv cultuuromstandigheden
• Passage --> aanmaak cryostock (anders: mutaties)
1.2.3 Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
• Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster & reagentia
• Aankoop & onderhoud proefdieren is duur + ethische vragen
1.3 Beperkingen van weefselculturen
1.3.1 Expertise
• Aseptisch werken --> tragere groei dan meeste bacteriën & schimmels
1.3.2 Hoeveelheid
• Laboschaal: max 109 cellen --> gramhoeveelheden (want 1 cel 10-9 gram)
• Industriële schaal vereist opschaling
,1.3.3 Instabiliteit
• Normale cellen: beperkte levensduur --> geleidelijk verlies van gedi\erentieerde eig. --> stoppen met
delen --> uiteindelijk sterven (senescentie)
• Continue cellen: aneuploïde aantal chromosomen
1.3.4 Cultuuromgeving (in vitro) versus in vivo
• Tweedimensionaal (in vivo: driedimensionaal)
o Cel-cel en cel-matrix interacties
o Cellen zijn beweeglijk
o Snelle celdeling
o Eén of twee celtypes blijven over --> heterotypische cel-cel interacties van weefsel verdwenen
• Oversimplificatie van het cultuurmedium
o Zenuwstelsel & endocriene organen ontbreken
• Cellulaire metabolisme is meer constant --> niet representatief
o Energiemetabolisme obv glycolyse + minder citroenzuurcyclus
Hoofdstuk 2: Cel- en weefselkweekculturen: definities --> 6
cultuurmethoden
2.1 Orgaanculturen
• Driedimensionale structuur & functie (gedeeltelijk) bewaard
• Rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme --> op vloeistof-gasinterfase gekweekt
• Kan di\erentiatie optreden van cellen
• Angiogenese
• Voordeel: cellulaire interacties
• Nadelen: telkens vers weefsel nodig & reproduceerbaarheid
2.2 Explant culturen
• Rechtstreeks geïsoleerd uit het organisme
• Bv: huidbiopten, spierbiopten & tumorweefsels
• Werkwijze:
o Chirurgisch uitsnijden --> grote hoeveelheid weefsel
o Naaldbiopt --> minder invasief, sneller, minder weefsel (<1 gram)
• Contaminatie bloed verminderen --> perfusie (fysiologische zoutoplossing)
• Microdissectie met infrarood-/ultravioletlaser --> weefsel van biopt isoleren
• Voordelen
o Cel-cel & cel-matrix interacties behouden
o Makkelijk manipuleerbaar
• Nadelen
o Beperkt houdbaar
o Cellen kunnen de-di\erentiëren (verliezen gespecialiseerde functie)
2.3 Primaire culturen
• Cellen rechtstreeks afkomstig van een bepaald orgaan of weefsel
• Meestal een heterogene mix van verschillende celtypes ==> co-cultuur
• Voordelen
o Co-cultuur --> cel-cel interacties (cfr in vivo)
o Ene celtype kan factoren (groei- & stollings-) uitscheiden voor ander celtype ==> paracriene\ect
• Nadelen
, o Instabiel
o Onderlinge verhouding van celtypes verandert, cellen kunnen de-di\erentiëren en verouderen,
bepaalde celtypes hebben groeivoordeel --> samenstelling van primaire cultuur verandert
2.4 Eindige celculturen
• Na subcultivatie van primaire celcultuur
• Een beperkt aantal celdelingen na het in kweek brengen --> senescentie
o Verkorting van uiteinden van chromosomen (telomeren) na celdeling
<-> stamcellen: verhoogde expressie van telomerase
Maximum 60-tal keer deken ==> Hayflick limiet
2.5 Geïmmortaliseerde cellijnen
• Cellen die oneindig lijken te delen
• = continue cellijnen --> monolaag of celsuspensie (sneller + hoge celdensiteit)
• Ontstaan: in vivo (kankercellen), spontaan (mutaties) of geïnduceerd: transformatie
2.6 Organotypische celculturen (zie hoofdstuk gespecialiseerde systemen)
• Gedeeltelijke reassociatie om driedimensionale structuur te creëren
o Creëren van een model voor cellulaire interacties
o Geen weefselstructuur
Voor- en nadelen van verschillende cultuurmethodes
Orgaankweek
• Aanhouden of groeien van weefselfragmenten of (delen van) organen in vitro
o Mogelijkheid tot di0erentiatie
o Intacte functie
Weefselkweek
• Aanhouden of groeien van weefselfragmenten in vitro
o Weefselstructuur hoeft niet functioneel te zijn
Celkweek
• Aanhouden en groeien van cellen in vitro
o Gedissocieerd van het oorspronkelijke weefsel door spontane migratie of mechanische of
enzymatische methoden
o Geen weefselstructuur
o Cellen groeien als mono- of multilayers op substraat of in suspensie
Organotypische cultuur
• Aanhouden en groeien van meer dan 1 celtype in vitro
o Creëren van een model voor cellulaire interacties
o Geen weefselstructuur
Primaire kweek
• Cellen rechtstreeks afkomstig van een bepaald orgaan of weefsel
Eindige cellijnen
• Cellen hebben een beperkt aantal celdelingen na het in kweek brengen
, Continue cellijnen
• Cellen die oneindig lijken te delen (immortalisatie, maligne transformatie)
Categorie Orgaancultuur Explantcultuur Celcultuur
Bron Embryonale Weefselfragmenten Dissociatiecultuur,
organen, adulte eindige cellijn
weefselfragmenten
Inspanning Makkelijk Matig Laag
Karakterisering Histologie Cytologie en merkers Biochemische,
moleculaire,
immunologische en
cytologische technieken
Histologie Informatief Moeilijk Niet van toepassing
Biochemische di\erentiatie Mogelijk Heterogeen Kan geïnduceerd worden
Propagatie Niet mogelijk Mogelijk door uitgroei cellen Standaardprocedures
Reproduceerbaarheid Veel variatie Veel variatie Weinig variatie
Kwantificatie Moeilijk Moeilijk Gemakkelijk
Hoofdstuk 3: Soorten cellen en culturen
3.1 Het verkrijgen van cellen voor celkweek: cellen migreren uit weefsel
• Voordelen
o Meeste cellen migreren (vnl. embryonale cellen)
o Nuttig bij kleine hoeveelheden weefsel
• Nadelen
o Slecht adhesieve eigenschappen van sommige cellen
o Selectie op basis van uitgroei
Protocol voor het spontaal laten migreren van cellen uit het weefsel
• Breng weefsel in een steriele petrischaal & was met steriel PBS. Snijd ev. dood weefsel & vet weg.
• Breng weefsel in nieuwe petrischaal --> snijd met 2 scalpels het weefsels in stukjes van 1 mm³.
• Pipetteer 10 ml PBS op weefselstukjes, zuig samen op & pipetteer in 50 ml tube. Laat weefselstukjes
bezinken & zuig PBS opnieuw af.
• Voeg 10-20 ml PBS toe, laat bezinken & verwijder PBS. Herhaal tot PBS helder blijft.
• Pipetteer cultuurmedium op de weefselstukjes.
