BIOTECHNOLOGIE
,INHOUD
1. Inleiding ................................................................................................................................................................................................................ 3
Biologische geneesmiddelen ................................................................................................................................................................................ 3
2. Eiwitten en de translatie ........................................................................................................................................................................................ 5
Eiwitsynthese ...................................................................................................................................................................................................... 5
Signaal sequentie .......................................................................................................................................................................................... 5
Post-translationele modificaties (PTM) ......................................................................................................................................................... 5
3. Biotechnologische technieken .............................................................................................................................................................................. 8
bibliotheek .......................................................................................................................................................................................................... 8
Eukaryotische bibliotheek............................................................................................................................................................................. 8
Screenen van bibliotheek ..................................................................................................................................................................................... 8
1) Eerste methode: Screenen met DNA-hybdridisatie ................................................................................................................................... 8
2) Tweede methode: screenen met immuno assay ...................................................................................................................................... 12
Southern en northern blotting ............................................................................................................................................................................. 15
1) Northern blotting ..................................................................................................................................................................................... 15
2) Southern blotting ..................................................................................................................................................................................... 16
4. Geneesmiddelen bereid door middel van recombinant DNA.................................................................................................................................. 19
Inleiding: culturen .............................................................................................................................................................................................. 19
Vergelijken bacterie-, gist- en zoogdiercelculturen ..................................................................................................................................... 20
Belangrijk concept binnen productiesystemen: cellbank ..................................................................................................................................... 22
Master-en working cellbank ........................................................................................................................................................................ 22
Productiesystemen: fermentatie ........................................................................................................................................................................ 24
Fermentatiesystemen ................................................................................................................................................................................. 24
Productiesystemen: celcultuur........................................................................................................................................................................... 30
Insuline ............................................................................................................................................................................................................. 31
Recombinant insuline op markt .................................................................................................................................................................. 31
Eigenschappen insuline .............................................................................................................................................................................. 32
Methodes voor Aanmaak recombinant insuline .......................................................................................................................................... 32
Tweede methode ......................................................................................................................................................................................... 34
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 36
Productieproces.......................................................................................................................................................................................... 36
vormen recombinant insuline op markt ...................................................................................................................................................... 37
Menselijk groeihormoon ..................................................................................................................................................................................... 38
Eigenschappen ............................................................................................................................................................................................ 38
Aanmaak recombinant groeihormoon ......................................................................................................................................................... 38
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 40
Vormen recombinant groeihormoon op markt ............................................................................................................................................ 40
Hepatitis B virus vaccin ...................................................................................................................................................................................... 41
Klassieke vaccins: 2 soorten ....................................................................................................................................................................... 41
Subunit vaccins ........................................................................................................................................................................................... 41
Hepatitis-B-vaccin: Heplisav B EPAR ........................................................................................................................................................... 44
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 44
1
, Tissue plasminogen activator ............................................................................................................................................................................. 45
Eigenschappen TPA ..................................................................................................................................................................................... 45
Rol TPA ........................................................................................................................................................................................................ 45
Recombinant TPA ........................................................................................................................................................................................ 45
Aanmaak recombinant TPA ......................................................................................................................................................................... 46
Vormen recombinant TPA op markt ............................................................................................................................................................. 49
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 50
5. Monoklonale antilichamen .................................................................................................................................................................................. 50
Wat zijn antilichamen? ....................................................................................................................................................................................... 50
Ontwikkeling humorale immuniteit ..................................................................................................................................................................... 54
Freunds complete adjuvant (FCA) en Freunds incomplete adjuvans (FIA) ................................................................................................... 54
Functies van antilichamen ................................................................................................................................................................................. 57
Agglutinering: IgG en IGm ............................................................................................................................................................................ 57
Complementcascade: Igg en igm ................................................................................................................................................................ 57
Opsonisatie: IGG ......................................................................................................................................................................................... 59
Antibody dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC): IGG .................................................................................................................... 61
IGA .............................................................................................................................................................................................................. 63
IGD .............................................................................................................................................................................................................. 63
IGE............................................................................................................................................................................................................... 63
Monoklonale antilichamen ................................................................................................................................................................................. 64
Aanmaak monoklonale antilichamen .......................................................................................................................................................... 64
Productie monoklonale antilichamen ......................................................................................................................................................... 65
Gebruik van monoklonale antilichamen ...................................................................................................................................................... 70
Muis/ chimere/ gehumaniseerde/ humane antilichamen op markt............................................................................................................. 81
6. Pharmaco-genomics-proteomics......................................................................................................................................................................... 88
Wat is pharmaco-genomics-proteomics? ........................................................................................................................................................... 88
Oorzaken heterogeniteit in GM-effect ......................................................................................................................................................... 88
Farmacogenetics vs farmacogenomics....................................................................................................................................................... 89
Farmacogenomics....................................................................................................................................................................................... 90
2
,1. INLEIDING
BIOLOGISCHE GENEESMIDDELEN
Sommige EW hebben therapeutisch nut
1) Bloedproducten = EW geoogst worden uit bloedafnames van vrijwilligers
• Valt onder classificatie van GM: voldoen aan vereisten
• >>> Albumine
- Vrijwilligers doneren → opzuivering (↔ recombinant insuline: niet uit donors)
- Meest voorkomend in bloed of plasma
- Relatief weinig therapeutisch potentieel! WEL als dragerEW
- Geen biotechnologisch product/recombinant, valt wel onder GM
• Opzuiveringsstappen
- Grootste vervuiling = water, ook partikels afgestorven cellen, verschillende soorten
opzuivering
- Affiniteitschromatografie = AL gebruikt om gewenste EW te capteren
- Verwijderen van risico’s = virale contaminatie: stappen inbouwen om dit te verwijderen
• Immunoglobines = AL, voor patiënt die zelf <<< immunoglobines produceert = vrije vogel voor
infecties → toch bescherming door toedienen immunoglobines geoogst uit plasma/bloed
van vrijwilligers, of bij bepaalde infectie ter bescherming (hyperimmune globulines)
Niet alles wat biologisch is, is biotechnologie: biotechnologie = knutselen! Zo veranderd, dat niet op
spontane wijze in natuur voor komt
2) Biotechnologische GM: buiten lichaam van mens geproduceerd, ↔ recombinante EW kunnen
aangemaakt worden in bacteriën, gisten, zoogdiercellen, proefdieren (in biologische systeem)
• Recombinante EW veelal gebruikt: bv. insuline, bv. enzymen in brood (broodverbeteraars) =
recombinante EW/ opgezuiverd uit bacteriecultuur
- Broodverbeteraars goedkoper dan insuline: andere regelgeving
- Bij broodverbeteraar: eventuele contaminatie wordt afgedood door hoge temperatuur
- ↔ Therapeutische EW: in lichaam! Veiligheid, zuiverheid en wetenschappelijk bewijs ≠
• Monoklonale AL: heel groot in vergelijking met insuline (is heel klein)
- Hoge specificiteit en lage toxiciteit
- Voordeel: kan gebruikt worden tegen bepaald EW/ receptor + snel bekomen (bv. qua
opzuivering: AL zijn gelijkend op elkaar tenzij variabel domein) + goede veiligheid indien
gelijkend want lichaam zit sowieso vol met AL
- Nog steeds duur
• Fusie-EW:
- mAb en recombinante EW: maken zodat ze goed lijken op natuurlijke EW omwille van
immuunsysteem → want immuunrespons tegen GM → GM werkt niet meer na tijd
- FusieEW: zijn fusie tussen minstens 2 andere EW om zo nieuw EW te creëren die van
nature niet voor komt bij patiënt, bestaat uit verschillende stukken EW die van nature wel
voorkomen → nieuwe biologische functualiteiten creëren
- Door genetische code (DNA-streng) te koppelen op genetisch niveau
- Voorzichtig zijn met kans op immuunherkenning patiënt (zijn trucjes voor)
3
, 3) Vaccins
• Sommige recombinant, anderen zijn geen EW-GM = covid vaccin = mRNA vaccin = proteïnen
(spikes) worden geproduceerd in lichaam van patiënt op basis van ingebrachtte DNA-code =
immuunrepons
4) ATMP = geavanceerde therapeutische GM gebaseerd op genen, weefsels of cellen
• Bv. CAR-T-cells, voor leukemie, bloedafname bij patiënt: witte bloedcellen (T-cellen)
opzuiveren, als doel om andere cellen af te doden, in T-cellen nieuwe receptor steken =
recombinant EW → binden wanneer ze leukemiecel herkennen → aanvallen
• Cel en gentherapie: bv. CAR-t cellen, cellen uit lichaam, genetische modificatie, genetisch
gemodificeerde cellen terug in lichaam
• Celtherapie: want leukemie weggehaald uit patiënt, gentherapie: genconstruct toedienen
aan patient, genetische modificatie in cellen van lichaam, cel en gentherapie: cellen uit
lichaam weghalen, genetische modificatie uitvoeren (gentherapie), genetische cellen weer
inbrengen (zo meer controle)
• Bezorgdheid: door gentherapie cellen induceren om zelf tumors te worden (later)
• Tissue engineered GM: m.b.t. weefsels (niet cellen) maar ≠ transplantatie: orgaan genetisch
aanpassen via gentherapie
Recombinant Insuline Genentech = 1e recombinant EW dat via recombinante DNA techniek op markt is
gekomen
• Genentech = bedrijf dat dit op markt bracht
• Venture capitalist = mensen met kapitaal, die hier iets mee willen doen, investeren in risicovolle
zaken
Biotechnologie = gebruik van biologische systemen, levende organismen, derivaten om verschillende GM
te produceren
• Iets geïsoleerd uit plant ≠ biotechnologie
• Mét manipulatie van DNA/RNA/EW, deze vindt niet spontaan in de natuur plaats (bv. bacterie die
menselijk insuline produceert door recombineren DNA)
FDA: regelend orgaan voor Verenigde Staten, in Europa oorspronkelijk niet, DUS GM op Europese markt:
dossier per individueel land indienen → niet evident → ontstaan EMA, indien enkel op Belgische markt:
nationale procedure
• Voor aantal zaken: verplichte centrale route via EMA, verplicht voor:
- GM met nieuwe actieve substantie, kanker GM, diabetes GM, GM voor immuun
aandoeningen, GM voor virale aandoeningen, GM die gebruik maken van biotechnologisch
proces, ATMP’s, orphan medicines = voor orphan diseases (ziektes die niet frequent voor
komen)
- Guidelines voor farma bedrijven die deze producten ontwikkelen (juiste
kwaliteitscontroles…) door EMA uitgeschreven
- ICH guidelines = zijn van tel wereldwijd (voor GM op internationale markt), onderverdeeld,
quality guidelines for biologics belangrijk
- Zo bestaat er bv. algemene guidline die slaat op alle EW die via recombinante techniek
worden aangemaakt, alsook specifiekere die zich bv. richten op monoklonale AL
- Drug substance bij EW GM = recombinant EW zelf (bv. insulineEW, geoogst en opgezuiverd )
↔ drug product, in vial, wat je verkoopt (guidelines vaak opgesplits per DS en DP)
- Worden steeds aangepast, gebruik meest recente versie
4
,2. EIWITTEN EN DE TRANSLATIE
EIWITSYNTHESE
Recombinant EW: kan in cytoplasma behouden worden/ gesecreteerd in cultuurmedium/ in
periplasmatische ruimte afhankelijk van signaalsequentie
• Belangrijk! Wat beste? Afhankelijk van context
• Achterhalen aan de hand van experiment, kijken naar rendement
SIGNAAL SEQUENTIE
Signaalsequentie = soortspecifiek, menselijk signaalsequentie werkt niet in bacteriën en vice versa
• Eerste stukje: peptide die ervoor zorgt dat EW op bepaalde plaats terecht komt in cel
- In ER/ golgi lumen/ gesecreteerd in medium
- ~ Sequentie peptide, gecodeerd door DNA sequentie = eerste stuk van bepaald gen
• Signaal sequentie wordt eraf geknipt door peptidase, vervolgens EW gesecreteerd op plaats in
kwestie
- Modificaties (post-translationeel)
- Wijzigen van AZ → verschillende EW
- Bv. glycosilatie: koppelen van polysachardien op EW in ER/ golgi lumen: EW moet hier komen
= glycoproteïne
POST-TRANSLATIONELE MODIFICATIES (PTM)
1) DISULFIDE BINDING
= Tertaire/ quaternaire structuur wordt hierdoor verstevigd (ook bij AL in B-cellen: lichte en zware ketesn
gekoppeld)
• E. coli: enkel in periplasma (ruimte tussen celmembraan en celwand), niet in ER, kan wel
geengineerd worden
• Eukaryoten: door oxidatieve enzymatische stappen in ER
• Insuline: klein EW met 2 polypeptide ketens met disulfide bruggen, vaak geproduceerd in E. coli
= hebben disulfidebruggen niet zomaar (later)
5
,2) GLYCOSILATIE
• Ongeveer 70% van biotechnologische GM zijn
glycoproteinen, inclusief mAb
• Insuline = geen glycoproteine
• Suikers zijn N-linked (op asparagine) in
eukaryoten (ENKEL !! Niet bij E. coli)
• In ER en golgi systeem
• O-linked enkel in golgi systeem (op serine/ threonine)
N-LINKED
• Op asparagines op consensus sequentie
- Asparagine AZ zelf + X (eender welk AZ) + serine/ threonine
• Veel vertakkingen
• Geconserveerd: bijna alle N-linked
polysachariden hebben gemeenschappelijk stuk
- 2 N-acetylglucosamineresiduen
- 3 mannose residuen
- Core penatasachardie kan nog verder vertakt
worden = antennes door fucoses
• Typisch verschillende glycosilaties: iso-vormen =
‘een’ glycoproteine ≠ 1 glycosilatie van 1 EW
→ High mannose: mannoses = eindstandige monosachariden
→ Complex: vertakkingen zijn geen mannoses
→ Hybdride: sommige vertakkingen eindigen niet op mannose, ander wel
N-LINKING: TRIMMING EN BRANCHING
• Bij EW in ER = groep enzymen aanwezig voor
trimming en branching
• Als eerste: koppeling aan asparagine
- Polysachariden worden getrimmed (stukjes
afgeknipt) ↔ ook enzymen aanwezig die
vertakkingen er weer opzetten = branching
- = Isovormen: EW dragen verschillende
glycosilatievormen, is een mengsel
- Isovormverdeling kan verschillen, echter
grotendeels dezelfde
- Studies: comparabiliteit: biosimilars = biologicas, EW-GM-generieken zijn geen exacte
kopieën = anders dan bij small-molecule-generieken: niet op markt zonder klinische studies
6
, GLYCOSILATIE IN EUKARYOTEN
• Niet overal hetzelfde
- Gist: veel mannose glycosilaties (high mannose), therapeutisch vaak niet bruikbaar
- Insecten: simpel en niet vertakt
- Zoogdieren: andere residu-verdeling dan mens
→ Bij mens: mutatie in 1 van genen voor enzymes = afwijkende glycosilaties
→ Aanleiding tot verschil in werking glycoproteïnen leidt tot immunogeniciteit: werking
teniet
• Idealiter: GM zelfde glycosilaties als wat in lichaam voorkomt
- Tumorcellen (menselijke cellen) uit patiënt halen en opkweken voor productie echter geen
goed idee: virussen
- Werken met zoogdiercellen: ook virussen maar zijn aangepast aan dier dus minder gevaarlijk
- Voor glycosilaties: cellijnen gebruiken geselecteerd met zelfde mutatie op enzymen door
toeval
EXPRESSIE SYSTEMEN
BACTERIËN
• Geen: voeren geen glycosilaties uit
• Kan wel geengeneerd worden: genen voor enzymsets tot expressie laten komen in bacteriën
GISTEN
• Hypermannolsylatie: antigeen, bij mens leidt dit tot immuunrespons
- Niet gewenst tenzij vaccin: wél immunogene reactie
• Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
• Studies gisten/ AZ invoegen waarop later chemische glycosylatie kan uitgevoerd worden
- Controle over welk oligosacharide gekoppeld wordt = glycoproteïne geen mengsel meer maar
één glycovorm
ZOOGDIERCEL-CULTUREN
• Meeste zoogdiercellen maken antigene glycosilatie aan
• Humane apecellen en CHO en baby hamster kidney (BHK) niet
- Zijn tumorcellen
- CHO: chinese hamster ovaries cells: door mutaties correcte glycosilaties
3) FOSFORYLATIE
= Is weinig stabiel dus wordt niet veel gedaan bij biotechnologische GM ↔ biologisch: EW neemt hierdoor
activatiestatus aan bij signaaltransductie: fosforylatie van EW → signaal naar celkern
4) SULFATATIE
• Tyrosinesulfatatie door tyrosylproteinesulfotransferase (TPST) in golgi apparat
• Bij gesecreteerde EW en extracellulaire delen van membraanEW
• Bij dieren en planten, niet bij prokaryoten en gisten
• Bestaat variabiliteit in: moet onder controle zijn
7
,INHOUD
1. Inleiding ................................................................................................................................................................................................................ 3
Biologische geneesmiddelen ................................................................................................................................................................................ 3
2. Eiwitten en de translatie ........................................................................................................................................................................................ 5
Eiwitsynthese ...................................................................................................................................................................................................... 5
Signaal sequentie .......................................................................................................................................................................................... 5
Post-translationele modificaties (PTM) ......................................................................................................................................................... 5
3. Biotechnologische technieken .............................................................................................................................................................................. 8
bibliotheek .......................................................................................................................................................................................................... 8
Eukaryotische bibliotheek............................................................................................................................................................................. 8
Screenen van bibliotheek ..................................................................................................................................................................................... 8
1) Eerste methode: Screenen met DNA-hybdridisatie ................................................................................................................................... 8
2) Tweede methode: screenen met immuno assay ...................................................................................................................................... 12
Southern en northern blotting ............................................................................................................................................................................. 15
1) Northern blotting ..................................................................................................................................................................................... 15
2) Southern blotting ..................................................................................................................................................................................... 16
4. Geneesmiddelen bereid door middel van recombinant DNA.................................................................................................................................. 19
Inleiding: culturen .............................................................................................................................................................................................. 19
Vergelijken bacterie-, gist- en zoogdiercelculturen ..................................................................................................................................... 20
Belangrijk concept binnen productiesystemen: cellbank ..................................................................................................................................... 22
Master-en working cellbank ........................................................................................................................................................................ 22
Productiesystemen: fermentatie ........................................................................................................................................................................ 24
Fermentatiesystemen ................................................................................................................................................................................. 24
Productiesystemen: celcultuur........................................................................................................................................................................... 30
Insuline ............................................................................................................................................................................................................. 31
Recombinant insuline op markt .................................................................................................................................................................. 31
Eigenschappen insuline .............................................................................................................................................................................. 32
Methodes voor Aanmaak recombinant insuline .......................................................................................................................................... 32
Tweede methode ......................................................................................................................................................................................... 34
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 36
Productieproces.......................................................................................................................................................................................... 36
vormen recombinant insuline op markt ...................................................................................................................................................... 37
Menselijk groeihormoon ..................................................................................................................................................................................... 38
Eigenschappen ............................................................................................................................................................................................ 38
Aanmaak recombinant groeihormoon ......................................................................................................................................................... 38
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 40
Vormen recombinant groeihormoon op markt ............................................................................................................................................ 40
Hepatitis B virus vaccin ...................................................................................................................................................................................... 41
Klassieke vaccins: 2 soorten ....................................................................................................................................................................... 41
Subunit vaccins ........................................................................................................................................................................................... 41
Hepatitis-B-vaccin: Heplisav B EPAR ........................................................................................................................................................... 44
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 44
1
, Tissue plasminogen activator ............................................................................................................................................................................. 45
Eigenschappen TPA ..................................................................................................................................................................................... 45
Rol TPA ........................................................................................................................................................................................................ 45
Recombinant TPA ........................................................................................................................................................................................ 45
Aanmaak recombinant TPA ......................................................................................................................................................................... 46
Vormen recombinant TPA op markt ............................................................................................................................................................. 49
Opzuivering ................................................................................................................................................................................................. 50
5. Monoklonale antilichamen .................................................................................................................................................................................. 50
Wat zijn antilichamen? ....................................................................................................................................................................................... 50
Ontwikkeling humorale immuniteit ..................................................................................................................................................................... 54
Freunds complete adjuvant (FCA) en Freunds incomplete adjuvans (FIA) ................................................................................................... 54
Functies van antilichamen ................................................................................................................................................................................. 57
Agglutinering: IgG en IGm ............................................................................................................................................................................ 57
Complementcascade: Igg en igm ................................................................................................................................................................ 57
Opsonisatie: IGG ......................................................................................................................................................................................... 59
Antibody dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC): IGG .................................................................................................................... 61
IGA .............................................................................................................................................................................................................. 63
IGD .............................................................................................................................................................................................................. 63
IGE............................................................................................................................................................................................................... 63
Monoklonale antilichamen ................................................................................................................................................................................. 64
Aanmaak monoklonale antilichamen .......................................................................................................................................................... 64
Productie monoklonale antilichamen ......................................................................................................................................................... 65
Gebruik van monoklonale antilichamen ...................................................................................................................................................... 70
Muis/ chimere/ gehumaniseerde/ humane antilichamen op markt............................................................................................................. 81
6. Pharmaco-genomics-proteomics......................................................................................................................................................................... 88
Wat is pharmaco-genomics-proteomics? ........................................................................................................................................................... 88
Oorzaken heterogeniteit in GM-effect ......................................................................................................................................................... 88
Farmacogenetics vs farmacogenomics....................................................................................................................................................... 89
Farmacogenomics....................................................................................................................................................................................... 90
2
,1. INLEIDING
BIOLOGISCHE GENEESMIDDELEN
Sommige EW hebben therapeutisch nut
1) Bloedproducten = EW geoogst worden uit bloedafnames van vrijwilligers
• Valt onder classificatie van GM: voldoen aan vereisten
• >>> Albumine
- Vrijwilligers doneren → opzuivering (↔ recombinant insuline: niet uit donors)
- Meest voorkomend in bloed of plasma
- Relatief weinig therapeutisch potentieel! WEL als dragerEW
- Geen biotechnologisch product/recombinant, valt wel onder GM
• Opzuiveringsstappen
- Grootste vervuiling = water, ook partikels afgestorven cellen, verschillende soorten
opzuivering
- Affiniteitschromatografie = AL gebruikt om gewenste EW te capteren
- Verwijderen van risico’s = virale contaminatie: stappen inbouwen om dit te verwijderen
• Immunoglobines = AL, voor patiënt die zelf <<< immunoglobines produceert = vrije vogel voor
infecties → toch bescherming door toedienen immunoglobines geoogst uit plasma/bloed
van vrijwilligers, of bij bepaalde infectie ter bescherming (hyperimmune globulines)
Niet alles wat biologisch is, is biotechnologie: biotechnologie = knutselen! Zo veranderd, dat niet op
spontane wijze in natuur voor komt
2) Biotechnologische GM: buiten lichaam van mens geproduceerd, ↔ recombinante EW kunnen
aangemaakt worden in bacteriën, gisten, zoogdiercellen, proefdieren (in biologische systeem)
• Recombinante EW veelal gebruikt: bv. insuline, bv. enzymen in brood (broodverbeteraars) =
recombinante EW/ opgezuiverd uit bacteriecultuur
- Broodverbeteraars goedkoper dan insuline: andere regelgeving
- Bij broodverbeteraar: eventuele contaminatie wordt afgedood door hoge temperatuur
- ↔ Therapeutische EW: in lichaam! Veiligheid, zuiverheid en wetenschappelijk bewijs ≠
• Monoklonale AL: heel groot in vergelijking met insuline (is heel klein)
- Hoge specificiteit en lage toxiciteit
- Voordeel: kan gebruikt worden tegen bepaald EW/ receptor + snel bekomen (bv. qua
opzuivering: AL zijn gelijkend op elkaar tenzij variabel domein) + goede veiligheid indien
gelijkend want lichaam zit sowieso vol met AL
- Nog steeds duur
• Fusie-EW:
- mAb en recombinante EW: maken zodat ze goed lijken op natuurlijke EW omwille van
immuunsysteem → want immuunrespons tegen GM → GM werkt niet meer na tijd
- FusieEW: zijn fusie tussen minstens 2 andere EW om zo nieuw EW te creëren die van
nature niet voor komt bij patiënt, bestaat uit verschillende stukken EW die van nature wel
voorkomen → nieuwe biologische functualiteiten creëren
- Door genetische code (DNA-streng) te koppelen op genetisch niveau
- Voorzichtig zijn met kans op immuunherkenning patiënt (zijn trucjes voor)
3
, 3) Vaccins
• Sommige recombinant, anderen zijn geen EW-GM = covid vaccin = mRNA vaccin = proteïnen
(spikes) worden geproduceerd in lichaam van patiënt op basis van ingebrachtte DNA-code =
immuunrepons
4) ATMP = geavanceerde therapeutische GM gebaseerd op genen, weefsels of cellen
• Bv. CAR-T-cells, voor leukemie, bloedafname bij patiënt: witte bloedcellen (T-cellen)
opzuiveren, als doel om andere cellen af te doden, in T-cellen nieuwe receptor steken =
recombinant EW → binden wanneer ze leukemiecel herkennen → aanvallen
• Cel en gentherapie: bv. CAR-t cellen, cellen uit lichaam, genetische modificatie, genetisch
gemodificeerde cellen terug in lichaam
• Celtherapie: want leukemie weggehaald uit patiënt, gentherapie: genconstruct toedienen
aan patient, genetische modificatie in cellen van lichaam, cel en gentherapie: cellen uit
lichaam weghalen, genetische modificatie uitvoeren (gentherapie), genetische cellen weer
inbrengen (zo meer controle)
• Bezorgdheid: door gentherapie cellen induceren om zelf tumors te worden (later)
• Tissue engineered GM: m.b.t. weefsels (niet cellen) maar ≠ transplantatie: orgaan genetisch
aanpassen via gentherapie
Recombinant Insuline Genentech = 1e recombinant EW dat via recombinante DNA techniek op markt is
gekomen
• Genentech = bedrijf dat dit op markt bracht
• Venture capitalist = mensen met kapitaal, die hier iets mee willen doen, investeren in risicovolle
zaken
Biotechnologie = gebruik van biologische systemen, levende organismen, derivaten om verschillende GM
te produceren
• Iets geïsoleerd uit plant ≠ biotechnologie
• Mét manipulatie van DNA/RNA/EW, deze vindt niet spontaan in de natuur plaats (bv. bacterie die
menselijk insuline produceert door recombineren DNA)
FDA: regelend orgaan voor Verenigde Staten, in Europa oorspronkelijk niet, DUS GM op Europese markt:
dossier per individueel land indienen → niet evident → ontstaan EMA, indien enkel op Belgische markt:
nationale procedure
• Voor aantal zaken: verplichte centrale route via EMA, verplicht voor:
- GM met nieuwe actieve substantie, kanker GM, diabetes GM, GM voor immuun
aandoeningen, GM voor virale aandoeningen, GM die gebruik maken van biotechnologisch
proces, ATMP’s, orphan medicines = voor orphan diseases (ziektes die niet frequent voor
komen)
- Guidelines voor farma bedrijven die deze producten ontwikkelen (juiste
kwaliteitscontroles…) door EMA uitgeschreven
- ICH guidelines = zijn van tel wereldwijd (voor GM op internationale markt), onderverdeeld,
quality guidelines for biologics belangrijk
- Zo bestaat er bv. algemene guidline die slaat op alle EW die via recombinante techniek
worden aangemaakt, alsook specifiekere die zich bv. richten op monoklonale AL
- Drug substance bij EW GM = recombinant EW zelf (bv. insulineEW, geoogst en opgezuiverd )
↔ drug product, in vial, wat je verkoopt (guidelines vaak opgesplits per DS en DP)
- Worden steeds aangepast, gebruik meest recente versie
4
,2. EIWITTEN EN DE TRANSLATIE
EIWITSYNTHESE
Recombinant EW: kan in cytoplasma behouden worden/ gesecreteerd in cultuurmedium/ in
periplasmatische ruimte afhankelijk van signaalsequentie
• Belangrijk! Wat beste? Afhankelijk van context
• Achterhalen aan de hand van experiment, kijken naar rendement
SIGNAAL SEQUENTIE
Signaalsequentie = soortspecifiek, menselijk signaalsequentie werkt niet in bacteriën en vice versa
• Eerste stukje: peptide die ervoor zorgt dat EW op bepaalde plaats terecht komt in cel
- In ER/ golgi lumen/ gesecreteerd in medium
- ~ Sequentie peptide, gecodeerd door DNA sequentie = eerste stuk van bepaald gen
• Signaal sequentie wordt eraf geknipt door peptidase, vervolgens EW gesecreteerd op plaats in
kwestie
- Modificaties (post-translationeel)
- Wijzigen van AZ → verschillende EW
- Bv. glycosilatie: koppelen van polysachardien op EW in ER/ golgi lumen: EW moet hier komen
= glycoproteïne
POST-TRANSLATIONELE MODIFICATIES (PTM)
1) DISULFIDE BINDING
= Tertaire/ quaternaire structuur wordt hierdoor verstevigd (ook bij AL in B-cellen: lichte en zware ketesn
gekoppeld)
• E. coli: enkel in periplasma (ruimte tussen celmembraan en celwand), niet in ER, kan wel
geengineerd worden
• Eukaryoten: door oxidatieve enzymatische stappen in ER
• Insuline: klein EW met 2 polypeptide ketens met disulfide bruggen, vaak geproduceerd in E. coli
= hebben disulfidebruggen niet zomaar (later)
5
,2) GLYCOSILATIE
• Ongeveer 70% van biotechnologische GM zijn
glycoproteinen, inclusief mAb
• Insuline = geen glycoproteine
• Suikers zijn N-linked (op asparagine) in
eukaryoten (ENKEL !! Niet bij E. coli)
• In ER en golgi systeem
• O-linked enkel in golgi systeem (op serine/ threonine)
N-LINKED
• Op asparagines op consensus sequentie
- Asparagine AZ zelf + X (eender welk AZ) + serine/ threonine
• Veel vertakkingen
• Geconserveerd: bijna alle N-linked
polysachariden hebben gemeenschappelijk stuk
- 2 N-acetylglucosamineresiduen
- 3 mannose residuen
- Core penatasachardie kan nog verder vertakt
worden = antennes door fucoses
• Typisch verschillende glycosilaties: iso-vormen =
‘een’ glycoproteine ≠ 1 glycosilatie van 1 EW
→ High mannose: mannoses = eindstandige monosachariden
→ Complex: vertakkingen zijn geen mannoses
→ Hybdride: sommige vertakkingen eindigen niet op mannose, ander wel
N-LINKING: TRIMMING EN BRANCHING
• Bij EW in ER = groep enzymen aanwezig voor
trimming en branching
• Als eerste: koppeling aan asparagine
- Polysachariden worden getrimmed (stukjes
afgeknipt) ↔ ook enzymen aanwezig die
vertakkingen er weer opzetten = branching
- = Isovormen: EW dragen verschillende
glycosilatievormen, is een mengsel
- Isovormverdeling kan verschillen, echter
grotendeels dezelfde
- Studies: comparabiliteit: biosimilars = biologicas, EW-GM-generieken zijn geen exacte
kopieën = anders dan bij small-molecule-generieken: niet op markt zonder klinische studies
6
, GLYCOSILATIE IN EUKARYOTEN
• Niet overal hetzelfde
- Gist: veel mannose glycosilaties (high mannose), therapeutisch vaak niet bruikbaar
- Insecten: simpel en niet vertakt
- Zoogdieren: andere residu-verdeling dan mens
→ Bij mens: mutatie in 1 van genen voor enzymes = afwijkende glycosilaties
→ Aanleiding tot verschil in werking glycoproteïnen leidt tot immunogeniciteit: werking
teniet
• Idealiter: GM zelfde glycosilaties als wat in lichaam voorkomt
- Tumorcellen (menselijke cellen) uit patiënt halen en opkweken voor productie echter geen
goed idee: virussen
- Werken met zoogdiercellen: ook virussen maar zijn aangepast aan dier dus minder gevaarlijk
- Voor glycosilaties: cellijnen gebruiken geselecteerd met zelfde mutatie op enzymen door
toeval
EXPRESSIE SYSTEMEN
BACTERIËN
• Geen: voeren geen glycosilaties uit
• Kan wel geengeneerd worden: genen voor enzymsets tot expressie laten komen in bacteriën
GISTEN
• Hypermannolsylatie: antigeen, bij mens leidt dit tot immuunrespons
- Niet gewenst tenzij vaccin: wél immunogene reactie
• Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
• Studies gisten/ AZ invoegen waarop later chemische glycosylatie kan uitgevoerd worden
- Controle over welk oligosacharide gekoppeld wordt = glycoproteïne geen mengsel meer maar
één glycovorm
ZOOGDIERCEL-CULTUREN
• Meeste zoogdiercellen maken antigene glycosilatie aan
• Humane apecellen en CHO en baby hamster kidney (BHK) niet
- Zijn tumorcellen
- CHO: chinese hamster ovaries cells: door mutaties correcte glycosilaties
3) FOSFORYLATIE
= Is weinig stabiel dus wordt niet veel gedaan bij biotechnologische GM ↔ biologisch: EW neemt hierdoor
activatiestatus aan bij signaaltransductie: fosforylatie van EW → signaal naar celkern
4) SULFATATIE
• Tyrosinesulfatatie door tyrosylproteinesulfotransferase (TPST) in golgi apparat
• Bij gesecreteerde EW en extracellulaire delen van membraanEW
• Bij dieren en planten, niet bij prokaryoten en gisten
• Bestaat variabiliteit in: moet onder controle zijn
7
