1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te
onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie:
➔ Zichtbaar licht valt op object en wordt weerkaatst ofwel met doorvallend licht
➔ Objecten afzonderlijk herkennen tot grootte van ongeveer 0.2 µm
➔ Fixatie:
- Weefsel in fixatievloeistof (fixator), covalente bindingen gevormd met
N-terminale groepen van eiwitten volgens cross-linking, eiwitten aan
cytoskelet en interagerende eiwitten vastgehecht waardoor structuur
zoveel mogelijk bewaard blijft
- Hoeveelheid fixator = minimaal 5 keer het volume van het weefsel
- Meest gebruikte fixator = formol (waterige oplossing op basis van
formaldehyde)
➔ Invriezen:
- Moet zeer snel gebeuren en enkel voor kleine weefselstukken
- Ingevroren in OCT oplossing (viskeuze oplossing van glycol en
bepaalde soorten hars) adhv onderkoeld isopentaan (-150°C)
- Vriescoupes gesneden met gekoeld microtoom
➔ Ingevoren weefsel: direct aangesneden op speciaal vriesmicrotoom, coupes na
korte fixatie onmiddellijk gekleurd
➔ Gefixeerd weefsel: nog zacht en kan niet direct aangesneden worden
- Ontdoen van water door oplopende concentratiegradiënt van
alcoholoplossingen
- Uitspoelen met tolueen of xyleen
- Voldoende hydrofoob en dus inbedden in paraffine
- Als paraffine opgesteven is dan coupes snijden op microtoom die dan
gekleurd kunnen worden
➔ Visualisatie voor levende cellen en moleculen
1
,TEM (transmissie elektronenmicroscopie):
➔ Elektronen doorheen preparaat schieten en opvangen op een gevoelige plaat
➔ Resolutie kan gaan tot 0.1 nm
➔ Inhoud of oppervlak van objecten afbeelden en ultrastructuur van cellen
waarnemen (virussen, DNA, …)
➔ Fixatie:
- Eerste fixatie: gekoelde glutaaraldehyde (4°C)
- Tweede fixatie: osmiumtetroxide (OsO4) (vetten bewaren en voegt
gewicht toe aan bepaalde locaties in weefsel zodat het beter zichtbaar
wordt) -> veel OsO4: elektrondens
➔ Gefixeerd weefsel ingebed in epoxyhars, zeer dunne coupes snijden met
diamantmes of glasmes
➔ Immunolabeling: weefsel gekleurd met antistof waar goudpartikel aanhangt om
specifieke moleculen aan te duiden in weefsel (zwarte puntjes op beeld)
2
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Fixatie proces:
Weefsel in fixatievloeistof (fixator) waardoor covalente bindingen gevormd worden met
de N-terminale groepen van eiwitten volgens cross-linking. De eiwitten worden zo aan
het cytoskelet en interagerende eiwitten vastgehecht waardoor de structuur zoveel
mogelijk bewaard wordt. De enzymen verliezen hun enzymatische werking tijdens het
fixatieproces. De duur varieert van 2-24 uur, afhankelijk van de grootte van het materiaal,
de gebruikte methode van fixatie en de fixator. De fixator dient minimaal 5x het volume
van het weefsel te zijn.
Formaldehyde:
➔ Gebruikt voor lichtmicroscopie
➔ Meest gebruikte fixator = formol (waterige oplossing van fomaldehyde)
➔ Nadeel: DNA en RNA kan gecrosslinked worden, dat is omkeerbaar maar door dit
proces worden de nucleïnezuren vaak gefragmenteerd, zolang de fragmenten niet
te klein zijn, niet te lang en optimaal bewaar worden is genetische analyse nog
steeds mogelijk
Glutaaraldehyde:
➔ Gebruikt voor elektronenmicroscopie
➔ Fragmenten zijn maximum 1-2 mm groot
➔ Fixatie in gekoelde glutaaraldehyde (4°C) gevolgd door tweede fixatie in
osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren, voegt ook extra gewicht toe aan
bepaalde locaties in het weefsel zodat ze beter zichtbaar worden
Verder verwerken:
Gefixeerd weefsel is zacht en kan dus niet direct gesneden worden -> inbedden in
paraffine of epoxyhars (afhankelijk van fixator). Materiaal eerst ontdoen van water door
weefsel in oplopende concentratiegradiënt van alcoholoplossingen te plaatsen, welk
wordt uitgespoeld met tolueen of xyleen. Deze oplossing is voldoende hydrofoob om in
te bedden. Wanneer het is opgesteven kan het gesneden worden in coupes op een
microtoom. Vervolgens kunnen de coupes gekleurd worden.
Bij formaldehyde wordt gebruik gemaakt van paraffine om weefsel in te bedden, de
coupes zijn 5 µm dik. Bij glutaaraldehyde wordt gebruik gemaakt van epoxyhars en door
de hardheid van dit materiaal dienen de coupes gesneden te worden met een
diamantmes of glasmes. De coupes zijn zeer dun, ongeveer 1 µm.
3
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruik
gemaakt van directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Immunohistochemie:
Immuno = antigeen-antistof reactie
Histo = weefsel
Chemie = scheikundige reactie om antigeen-antistof reactie zichtbaar te maken
Waarvoor gebruikt? Aantonen en lokaliseren van antigeen mbv specifieke antistoffen in
weefselcoupes. Onderzoek op eiwitniveau.
➔ Specifieke binding van antistoffen aan antigenen
➔ Antigenen = lichaamsvreemde stoffen waartegen antistoffen gevormd kunnen
worden
➔ Antistoffen = afweerproducten aangemaakt door het immunologisch
afweersysteem van de gastheer
➔ Antistoffen binden specifiek met het antigeen waar ze tegen gericht zijn
➔ Wanneer bepaald antigeen in weefselcoupe aanwezig is dan zal een hiertegen
gerichte antistof een immuuncomplex vormen thv dit antigeen. Deze
immuuncomplexen zijn als dusdanig niet zichtbaar, om de reactie zichtbaar te
maken wordt de antistof gebonden aan een fluorescerende molecule, enzym,
biotine of een goudpartikel.
➔ Antistof gebonden met een fluorescerende molecule: de reactie kan direct
gevisualiseerd worden met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Men
spreekt dan ook van immunofluorescentie.
Directe methode: 1 stapsmethode
➔ Antistof dat een bepaald antigeen moet opsporen is zelf gelabeld
➔ Snel, eenvoudig maar weinig signaalversterking en lage hoeveelheden antigeen
worden moeilijker gedetecteerd
➔ Gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid-
en nierbiopten
➔ Beste resultaat bekomen in vriescoupes en als label wordt dan meestal een
fluoresceïne gebruikt
4
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te
onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie:
➔ Zichtbaar licht valt op object en wordt weerkaatst ofwel met doorvallend licht
➔ Objecten afzonderlijk herkennen tot grootte van ongeveer 0.2 µm
➔ Fixatie:
- Weefsel in fixatievloeistof (fixator), covalente bindingen gevormd met
N-terminale groepen van eiwitten volgens cross-linking, eiwitten aan
cytoskelet en interagerende eiwitten vastgehecht waardoor structuur
zoveel mogelijk bewaard blijft
- Hoeveelheid fixator = minimaal 5 keer het volume van het weefsel
- Meest gebruikte fixator = formol (waterige oplossing op basis van
formaldehyde)
➔ Invriezen:
- Moet zeer snel gebeuren en enkel voor kleine weefselstukken
- Ingevroren in OCT oplossing (viskeuze oplossing van glycol en
bepaalde soorten hars) adhv onderkoeld isopentaan (-150°C)
- Vriescoupes gesneden met gekoeld microtoom
➔ Ingevoren weefsel: direct aangesneden op speciaal vriesmicrotoom, coupes na
korte fixatie onmiddellijk gekleurd
➔ Gefixeerd weefsel: nog zacht en kan niet direct aangesneden worden
- Ontdoen van water door oplopende concentratiegradiënt van
alcoholoplossingen
- Uitspoelen met tolueen of xyleen
- Voldoende hydrofoob en dus inbedden in paraffine
- Als paraffine opgesteven is dan coupes snijden op microtoom die dan
gekleurd kunnen worden
➔ Visualisatie voor levende cellen en moleculen
1
,TEM (transmissie elektronenmicroscopie):
➔ Elektronen doorheen preparaat schieten en opvangen op een gevoelige plaat
➔ Resolutie kan gaan tot 0.1 nm
➔ Inhoud of oppervlak van objecten afbeelden en ultrastructuur van cellen
waarnemen (virussen, DNA, …)
➔ Fixatie:
- Eerste fixatie: gekoelde glutaaraldehyde (4°C)
- Tweede fixatie: osmiumtetroxide (OsO4) (vetten bewaren en voegt
gewicht toe aan bepaalde locaties in weefsel zodat het beter zichtbaar
wordt) -> veel OsO4: elektrondens
➔ Gefixeerd weefsel ingebed in epoxyhars, zeer dunne coupes snijden met
diamantmes of glasmes
➔ Immunolabeling: weefsel gekleurd met antistof waar goudpartikel aanhangt om
specifieke moleculen aan te duiden in weefsel (zwarte puntjes op beeld)
2
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Fixatie proces:
Weefsel in fixatievloeistof (fixator) waardoor covalente bindingen gevormd worden met
de N-terminale groepen van eiwitten volgens cross-linking. De eiwitten worden zo aan
het cytoskelet en interagerende eiwitten vastgehecht waardoor de structuur zoveel
mogelijk bewaard wordt. De enzymen verliezen hun enzymatische werking tijdens het
fixatieproces. De duur varieert van 2-24 uur, afhankelijk van de grootte van het materiaal,
de gebruikte methode van fixatie en de fixator. De fixator dient minimaal 5x het volume
van het weefsel te zijn.
Formaldehyde:
➔ Gebruikt voor lichtmicroscopie
➔ Meest gebruikte fixator = formol (waterige oplossing van fomaldehyde)
➔ Nadeel: DNA en RNA kan gecrosslinked worden, dat is omkeerbaar maar door dit
proces worden de nucleïnezuren vaak gefragmenteerd, zolang de fragmenten niet
te klein zijn, niet te lang en optimaal bewaar worden is genetische analyse nog
steeds mogelijk
Glutaaraldehyde:
➔ Gebruikt voor elektronenmicroscopie
➔ Fragmenten zijn maximum 1-2 mm groot
➔ Fixatie in gekoelde glutaaraldehyde (4°C) gevolgd door tweede fixatie in
osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren, voegt ook extra gewicht toe aan
bepaalde locaties in het weefsel zodat ze beter zichtbaar worden
Verder verwerken:
Gefixeerd weefsel is zacht en kan dus niet direct gesneden worden -> inbedden in
paraffine of epoxyhars (afhankelijk van fixator). Materiaal eerst ontdoen van water door
weefsel in oplopende concentratiegradiënt van alcoholoplossingen te plaatsen, welk
wordt uitgespoeld met tolueen of xyleen. Deze oplossing is voldoende hydrofoob om in
te bedden. Wanneer het is opgesteven kan het gesneden worden in coupes op een
microtoom. Vervolgens kunnen de coupes gekleurd worden.
Bij formaldehyde wordt gebruik gemaakt van paraffine om weefsel in te bedden, de
coupes zijn 5 µm dik. Bij glutaaraldehyde wordt gebruik gemaakt van epoxyhars en door
de hardheid van dit materiaal dienen de coupes gesneden te worden met een
diamantmes of glasmes. De coupes zijn zeer dun, ongeveer 1 µm.
3
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruik
gemaakt van directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Immunohistochemie:
Immuno = antigeen-antistof reactie
Histo = weefsel
Chemie = scheikundige reactie om antigeen-antistof reactie zichtbaar te maken
Waarvoor gebruikt? Aantonen en lokaliseren van antigeen mbv specifieke antistoffen in
weefselcoupes. Onderzoek op eiwitniveau.
➔ Specifieke binding van antistoffen aan antigenen
➔ Antigenen = lichaamsvreemde stoffen waartegen antistoffen gevormd kunnen
worden
➔ Antistoffen = afweerproducten aangemaakt door het immunologisch
afweersysteem van de gastheer
➔ Antistoffen binden specifiek met het antigeen waar ze tegen gericht zijn
➔ Wanneer bepaald antigeen in weefselcoupe aanwezig is dan zal een hiertegen
gerichte antistof een immuuncomplex vormen thv dit antigeen. Deze
immuuncomplexen zijn als dusdanig niet zichtbaar, om de reactie zichtbaar te
maken wordt de antistof gebonden aan een fluorescerende molecule, enzym,
biotine of een goudpartikel.
➔ Antistof gebonden met een fluorescerende molecule: de reactie kan direct
gevisualiseerd worden met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Men
spreekt dan ook van immunofluorescentie.
Directe methode: 1 stapsmethode
➔ Antistof dat een bepaald antigeen moet opsporen is zelf gelabeld
➔ Snel, eenvoudig maar weinig signaalversterking en lage hoeveelheden antigeen
worden moeilijker gedetecteerd
➔ Gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid-
en nierbiopten
➔ Beste resultaat bekomen in vriescoupes en als label wordt dan meestal een
fluoresceïne gebruikt
4
