Microscopy and Image Analysis Samenvatting tentamen
Inhoudsopgave
Hoorcollege 1: Light and color ..............................................................................................2
Hoorcollege 2: Basic optics ................................................................................................ 12
Hoorcollege 3: Contrast techniques ................................................................................... 24
Hoorcollege 4: Fluorescence Microscopy............................................................................ 32
Hoorcollege 5: Fluorescence Microscopy............................................................................ 43
Hoorcollege 6: Confocal Microscopy .................................................................................. 52
Hoorcollege 7: Super-resolution microscopy ....................................................................... 58
Hoorcollege 8: Live cell imaging I ........................................................................................ 64
Hoorcollege 9: Live cell imaging II ....................................................................................... 71
Hoorcollege 10: Visualising Cells Electron Microscopy (EM) ................................................ 78
Hoorcollege 11: Image analysis and Correlative light and electron microscopy..................... 83
Hoorcollege 12: Image analysis and Correlative light and electron microscopy..................... 88
,Hoorcollege 1: Light and color
Microscopie in het algemeen
Compound microscope = een microscoop die
zichtbaar licht omzet in een vergrootte afbeelding
van een object. Het heeft twee lenzen, een
objective lens en een eyepiece. De objective lens
(4x, 10x, 40x of 100x) zit dicht bij het sample en
wordt vermenigvuldigd door de eyepiece lens (10x)
in het oculair om een hogere vergroting te krijgen.
Bij een microscoop kan zowel de hoeveelheid
belichting aangepast worden als het contrast
(intensiteit) om een beter beeld te krijgen.
Om bepaalde samples zichtbaar te maken kunnen er kleuringen nodig zijn, zoals een Golgi
staining die neuronen donker kleurt of een H&E staining die cellen kleurt voor medische
diagnoses.
Widefield microscopie = het gehele sample wordt verlicht. Er wordt gebruik gemaakt van twee
lampen. Transmitted light gaat door het sample en het licht van een fluorescentie lamp wordt
gefilterd waardoor er één kleur over blijft. Het licht komt bij een spiegel die afhankelijk van de
golflengte het licht doorlaat of weerkaatst.
,Inverted microscope = kan gebruikt worden om levende cellen te bekijken. Anders moet het
medium met de cellen omgedraaid worden, dit is lastig.
Resolutie = de kleinste afstand waarbij men twee objecten nog als afzonderlijk kan
onderscheiden. Een hoge resolutie is een kleine afstand en dus een betere onderscheiding van
objecten.
➢ Resolutie = 1/d
➢ d = distance
➢ De resolutie die gehaald kan worden met een microscoop is ongeveer de helft van de
golflengte van het licht dat gebruikt wordt.
Licht microscopie Elektronen microscopie
Live-cell imaging; kijken naar levende cellen. Betere resolutie; kleinere onderdelen
bekijken.
Selective labeling; structuren beter Context; je krijgt een beeld van alles
onderscheiden. eromheen en wat daar gebeurt.
, Elektronen microscopie
• Transmissie elektronen microscoop (TEM) = de elektronen worden door een dun
preparaat heen geschoten en vervolgens op een fluorescerende plaat geprojecteerd
zodat ze zichtbaar worden.
• Scanning elektronen microscoop (SEM) = de microstructuur van materialen kan
zichtbaar gemaakt worden. De elektronenstraal wordt gebundeld op het gehele
materiaal geprojecteerd en het oppervlakte wordt volgens een raster afgetast. De
teruggekaatste of de door secundaire emissie vrijkomende elektronen worden
gedetecteerd en punt voor punt vastgelegd in een beeld.
Fluorescentie microscopie
Fluorescentie microscopie maakt gebruik van fluorescente kleurstoffen, zoals GFP, om
biologisch materiaal te kleuren. Deze fluorescentie kan ook gekoppeld worden aan bijvoorbeeld
eiwitten voor immunofluorescentie.
Confocale microscopie = een gespecialiseerde vorm van microscopie waarin er in één vlak
gekeken kan worden, en al het out-of-focus licht wordt weerkaatst, zodat er geen fluorescentie is
in de lagen boven en onder wat je wil bekijken. Er is controle over de diepte van het veld. Het
werkt met een laser waarbij er heel gefocust licht op één plek in het sample gebracht wordt. Dit
zorgt voor de diepte en een beter beeld.
Inhoudsopgave
Hoorcollege 1: Light and color ..............................................................................................2
Hoorcollege 2: Basic optics ................................................................................................ 12
Hoorcollege 3: Contrast techniques ................................................................................... 24
Hoorcollege 4: Fluorescence Microscopy............................................................................ 32
Hoorcollege 5: Fluorescence Microscopy............................................................................ 43
Hoorcollege 6: Confocal Microscopy .................................................................................. 52
Hoorcollege 7: Super-resolution microscopy ....................................................................... 58
Hoorcollege 8: Live cell imaging I ........................................................................................ 64
Hoorcollege 9: Live cell imaging II ....................................................................................... 71
Hoorcollege 10: Visualising Cells Electron Microscopy (EM) ................................................ 78
Hoorcollege 11: Image analysis and Correlative light and electron microscopy..................... 83
Hoorcollege 12: Image analysis and Correlative light and electron microscopy..................... 88
,Hoorcollege 1: Light and color
Microscopie in het algemeen
Compound microscope = een microscoop die
zichtbaar licht omzet in een vergrootte afbeelding
van een object. Het heeft twee lenzen, een
objective lens en een eyepiece. De objective lens
(4x, 10x, 40x of 100x) zit dicht bij het sample en
wordt vermenigvuldigd door de eyepiece lens (10x)
in het oculair om een hogere vergroting te krijgen.
Bij een microscoop kan zowel de hoeveelheid
belichting aangepast worden als het contrast
(intensiteit) om een beter beeld te krijgen.
Om bepaalde samples zichtbaar te maken kunnen er kleuringen nodig zijn, zoals een Golgi
staining die neuronen donker kleurt of een H&E staining die cellen kleurt voor medische
diagnoses.
Widefield microscopie = het gehele sample wordt verlicht. Er wordt gebruik gemaakt van twee
lampen. Transmitted light gaat door het sample en het licht van een fluorescentie lamp wordt
gefilterd waardoor er één kleur over blijft. Het licht komt bij een spiegel die afhankelijk van de
golflengte het licht doorlaat of weerkaatst.
,Inverted microscope = kan gebruikt worden om levende cellen te bekijken. Anders moet het
medium met de cellen omgedraaid worden, dit is lastig.
Resolutie = de kleinste afstand waarbij men twee objecten nog als afzonderlijk kan
onderscheiden. Een hoge resolutie is een kleine afstand en dus een betere onderscheiding van
objecten.
➢ Resolutie = 1/d
➢ d = distance
➢ De resolutie die gehaald kan worden met een microscoop is ongeveer de helft van de
golflengte van het licht dat gebruikt wordt.
Licht microscopie Elektronen microscopie
Live-cell imaging; kijken naar levende cellen. Betere resolutie; kleinere onderdelen
bekijken.
Selective labeling; structuren beter Context; je krijgt een beeld van alles
onderscheiden. eromheen en wat daar gebeurt.
, Elektronen microscopie
• Transmissie elektronen microscoop (TEM) = de elektronen worden door een dun
preparaat heen geschoten en vervolgens op een fluorescerende plaat geprojecteerd
zodat ze zichtbaar worden.
• Scanning elektronen microscoop (SEM) = de microstructuur van materialen kan
zichtbaar gemaakt worden. De elektronenstraal wordt gebundeld op het gehele
materiaal geprojecteerd en het oppervlakte wordt volgens een raster afgetast. De
teruggekaatste of de door secundaire emissie vrijkomende elektronen worden
gedetecteerd en punt voor punt vastgelegd in een beeld.
Fluorescentie microscopie
Fluorescentie microscopie maakt gebruik van fluorescente kleurstoffen, zoals GFP, om
biologisch materiaal te kleuren. Deze fluorescentie kan ook gekoppeld worden aan bijvoorbeeld
eiwitten voor immunofluorescentie.
Confocale microscopie = een gespecialiseerde vorm van microscopie waarin er in één vlak
gekeken kan worden, en al het out-of-focus licht wordt weerkaatst, zodat er geen fluorescentie is
in de lagen boven en onder wat je wil bekijken. Er is controle over de diepte van het veld. Het
werkt met een laser waarbij er heel gefocust licht op één plek in het sample gebracht wordt. Dit
zorgt voor de diepte en een beter beeld.
