2022-2023 Biomoleculen: analyse en scheiding Amelia Hajnus
Biomoleculen: analyse en scheiding
Deel 1: Proteïne-opzuivering
Wat zijn proteïnen ?
Belangrijke aminozuren:
pH < pKa: zijketen geprotoneerd
pH = pKa: helft geprotoneerd, helft gedeprotoneerd
pH > pKa: zijketen gedeprotoneerd
Primaire structuur eiwit: AZ sequentie
Secundaire structuur eiwit: α-helix en β-vouwblad
H-bruggen
Tertiaire structuur eiwit: disulfidebinding, ionische binding, H-bruggen, hydrofobe interacties
Quaternaire structuur eiwit: verschillende peptiden interageren
dimeren, trimeren, tetrameren,…
Posttranslationele modificaties: toevoeging nieuwe functionele groepen
Iso-elektrisch punt (IEP of pI): pH waarbij het proteïne geen netto positieve of negatieve lading heeft
2D-polyacrylamidegelelektroforese
Scheiding op basis van moleculair gewicht en pI
Hydrofobiciteit vs. Hydrofiliciteit: hydrofobe eiwitten aan binnenkant → membranen
1
,2022-2023 Biomoleculen: analyse en scheiding Amelia Hajnus
Absorptie door een eiwit
Absorberen licht bij 280 nm: tyrosine, tryptofaan en disulfidebruggen
! phenylalanine niet
Totale absorptie hangt af van extinctiecoëfficiënt ε [1/M cm]: wordt groter naarmate meer trp/tyr/S-S
Wet van Lambert-Beer: A = C * ε * L
C: concentratie [M]
L: lengte cuvet [cm]
Proteïne-opzuiveringstechnieken
Oplosbaarheid
Balans geladen, polaire en hydrofobe AZ aan oppervlak eiwit bepaalt oplosbaarheid
In neutrale zoutoplossing of organische solventen: proteïnen precipiteren/neerslaan in een bepaald bereik door
een lage oplosbaarheid
Ruwe manier op te fractioneren in ‘oplosbaarheidsfracties’
Zuiver proteïne verkrijgen onmogelijk doordat de oplosbaarheidsbereiken overlappen
Ammoniumsulfaatprecipitatie
= salting out
Proteïne in bufferoplossing is zeer sterk gehydrateerd: geladen groepen aan oppervlak trekken watermoleculen
aan en binden ze sterk
Toevoeging veel zout: zoutionen trekken watermoleculen weg van proteïne-oppervlakte (doordat ionen een
hogere ladingsdensiteit hebben) proteïne-moleculen gedwongen met elkaar te interageren + aggregeren
Elk proteïne begint te precipiteren vanaf bepaalde zoutconcentratie zonder dat hij denatureert
Pellet: precipitaten collecteren via centrifuge
Supernatans: bevat oplosbare deel
Doel: proteïne-mengsels fractioneren of concentreren
2
, 2022-2023 Biomoleculen: analyse en scheiding Amelia Hajnus
Lading
Verschillende oppervlakteladingen (afkomstig van glu, asp, his, lys, arg) die pH afhankelijk zijn → pI proteïne
Ionuitwisselaars
Ionenuitwisselaars: scheiden negatief geladen (anionen) en positief geladen (kationen) proteïnen volgens
gradiënt
Anionuitwisselaar Kationuitwisselaar
+ geladen hars/resin - geladen hard/resin
Bindt anionen Bindt kationen
Doorloop kationen Doorloop anionen
Elueren = gebonden ionen losmaken d.m.v. zoutoplossing
Eluaat = wat vrijkomt na stijging zoutconcnetratie
NaCl heeft grotere ladingsdensiteit → verdringt gebonden eiwitten → minst sterk gebonden eiwitten elueren
eerst bij laagste c(NaCl)
Elueren kan ook d.m.v. pH-gradiënt
Soorten:
1) Beads in oplossing: discontinue metingen met spectrofotometer
2) Zelf-bereide kolom startende van een slurry: discontinue metingen met spectrofotometer
3) Prepacked kolom: real-time monitoring
4) Chromatografiesystemen
Gradiënt elutie
Chromatogram:
x-as: volume dat over uitwisselaar is gelopen uitgedrukt in kolomvolumes
y-as: blauw = absorptie bij 280 nm als maat voor eiwitten die de kolom passeren
rood = c(NaCl) waarmee geëlueerd wordt
3
Biomoleculen: analyse en scheiding
Deel 1: Proteïne-opzuivering
Wat zijn proteïnen ?
Belangrijke aminozuren:
pH < pKa: zijketen geprotoneerd
pH = pKa: helft geprotoneerd, helft gedeprotoneerd
pH > pKa: zijketen gedeprotoneerd
Primaire structuur eiwit: AZ sequentie
Secundaire structuur eiwit: α-helix en β-vouwblad
H-bruggen
Tertiaire structuur eiwit: disulfidebinding, ionische binding, H-bruggen, hydrofobe interacties
Quaternaire structuur eiwit: verschillende peptiden interageren
dimeren, trimeren, tetrameren,…
Posttranslationele modificaties: toevoeging nieuwe functionele groepen
Iso-elektrisch punt (IEP of pI): pH waarbij het proteïne geen netto positieve of negatieve lading heeft
2D-polyacrylamidegelelektroforese
Scheiding op basis van moleculair gewicht en pI
Hydrofobiciteit vs. Hydrofiliciteit: hydrofobe eiwitten aan binnenkant → membranen
1
,2022-2023 Biomoleculen: analyse en scheiding Amelia Hajnus
Absorptie door een eiwit
Absorberen licht bij 280 nm: tyrosine, tryptofaan en disulfidebruggen
! phenylalanine niet
Totale absorptie hangt af van extinctiecoëfficiënt ε [1/M cm]: wordt groter naarmate meer trp/tyr/S-S
Wet van Lambert-Beer: A = C * ε * L
C: concentratie [M]
L: lengte cuvet [cm]
Proteïne-opzuiveringstechnieken
Oplosbaarheid
Balans geladen, polaire en hydrofobe AZ aan oppervlak eiwit bepaalt oplosbaarheid
In neutrale zoutoplossing of organische solventen: proteïnen precipiteren/neerslaan in een bepaald bereik door
een lage oplosbaarheid
Ruwe manier op te fractioneren in ‘oplosbaarheidsfracties’
Zuiver proteïne verkrijgen onmogelijk doordat de oplosbaarheidsbereiken overlappen
Ammoniumsulfaatprecipitatie
= salting out
Proteïne in bufferoplossing is zeer sterk gehydrateerd: geladen groepen aan oppervlak trekken watermoleculen
aan en binden ze sterk
Toevoeging veel zout: zoutionen trekken watermoleculen weg van proteïne-oppervlakte (doordat ionen een
hogere ladingsdensiteit hebben) proteïne-moleculen gedwongen met elkaar te interageren + aggregeren
Elk proteïne begint te precipiteren vanaf bepaalde zoutconcentratie zonder dat hij denatureert
Pellet: precipitaten collecteren via centrifuge
Supernatans: bevat oplosbare deel
Doel: proteïne-mengsels fractioneren of concentreren
2
, 2022-2023 Biomoleculen: analyse en scheiding Amelia Hajnus
Lading
Verschillende oppervlakteladingen (afkomstig van glu, asp, his, lys, arg) die pH afhankelijk zijn → pI proteïne
Ionuitwisselaars
Ionenuitwisselaars: scheiden negatief geladen (anionen) en positief geladen (kationen) proteïnen volgens
gradiënt
Anionuitwisselaar Kationuitwisselaar
+ geladen hars/resin - geladen hard/resin
Bindt anionen Bindt kationen
Doorloop kationen Doorloop anionen
Elueren = gebonden ionen losmaken d.m.v. zoutoplossing
Eluaat = wat vrijkomt na stijging zoutconcnetratie
NaCl heeft grotere ladingsdensiteit → verdringt gebonden eiwitten → minst sterk gebonden eiwitten elueren
eerst bij laagste c(NaCl)
Elueren kan ook d.m.v. pH-gradiënt
Soorten:
1) Beads in oplossing: discontinue metingen met spectrofotometer
2) Zelf-bereide kolom startende van een slurry: discontinue metingen met spectrofotometer
3) Prepacked kolom: real-time monitoring
4) Chromatografiesystemen
Gradiënt elutie
Chromatogram:
x-as: volume dat over uitwisselaar is gelopen uitgedrukt in kolomvolumes
y-as: blauw = absorptie bij 280 nm als maat voor eiwitten die de kolom passeren
rood = c(NaCl) waarmee geëlueerd wordt
3
