HPLC1 Samenvatting
Les 1
HPLC
- Hoge prestatie vloeistofchromatografie vroeger: hoge druk vloeistofchromatografie
- Buis met pakking stationaire fase
o Pakking bestaat uit silica
Niet-gemodificeerde silica = polair Normal-HPLC (N-HPLC)
Gemodificeerde silica = apolair Reversed Phase-HPLC (RP-HPLC)
Het omzetten van N-HPLC in RP-HPLC heet endcapping. Hierbij wordt
elke OH-groep omgezet in een niet-polaire groep
Er bestaan meerdere vormen van silica
Nadeel: bij een hoge pH zal er hydrolyse van de silicagel plaatsvinden,
waardoor het niet meer geschikt is voor HPLC
Dit kun je zien door snelle achteruitgang in efficiëntie, meer
piekverbreding en verhoging van de druk
- Doorstromen met vloeistof mobiele fase
o Bestaat meestal uit water, waterige bufferoplossing, water en organisch oplosmiddel
en mengsels van organische oplosmiddelen (vaak ook in gradiënt).
o Eluent moet van tevoren ontgast en gefiltreerd worden.
Ontgassing bijv. door doorstroming met helium
Voorkomt storingen aan de apparatuur
Ook de pomp moet stofvrij zijn.
- Stof verdeelt zich over mobiele en stationaire fase
o De stationaire fase vertraagt verschillende componenten
- Je wilt hoge schotelgetallen krijgen (>10000), dus lage schotelhoogtes kleine
deeltjesdiameter (dp) pakking nodig
L
o H=
N
H = schotelhoogte
N = schotelgetal
L = lengte kolom
o Om vloeistof toch er doorheen te krijgen, is er hoge (pomp)druk nodig.
- Apparatuur
, - Pomp
o Debiet (flow) F
F tussen 10 – 10000 μL/min
Zeer constant debiet nodig in verband met detectie
o Pmax = 40 MPA
o Diverse typen pompen beschikbaar
Twee pompen die onafhankelijk van elkaar werken binair pompsysteem
Nauwkeurige regeling van de twee oplosmiddelfracties
Zeswegkraan nodig duurder
- Injectiesysteem
o Zeswegkraan waarin een zogenaamde monsterlus is opgenomen
o Monsterkraan moet bestand zijn tegen hoge drukken en ‘dode’ ruimten moet
worden vermeden om extra piekverbreding te vermijden.
o Monster wordt hierin meteen vermengd met het oplosmiddel
- Kolom
o Eigenschappen
Roestvast staal
Lengte (L) 5-20 cm
Inwendige diameter 4-5 mm
Invloed verbinding kolom-detector op de uiteindelijke piekvorm
o De dode ruimten bij aansluitingen op de kolom moeten zo klein mogelijk zijn!
- Detector
o Tegenwoordig veelal gekoppeld aan UV-detector
Hoge gevoeligheid
Groot meetbereik
Vrij ongevoelig voor temperatuursveranderingen
o Computer maakt signaal zichtbaar
Wanneer pas je welke techniek toe?
- Vluchtig monster GC mogelijk
- Monster niet vluchtig (HP)LC mogelijk
- Grote moleculen GPC mogelijk
Wanneer HPLC toepassen
- Bij sterk polaire mengsels
- Hoge molecuulmassa’s
- Thermisch instabiele materialen
- Materialen met een neiging tot ionisatie
Formules zie formuleblad
∆ t R, j , i
- Resolutie: R j ,i=
2(σ t ¿ ¿ , j−σ t ,i) ¿
L
Retentietijd: t R , i= ( 1+k i ) =t R , 0 (1+k i)
' '
-
μ
( )
2
tR
- Schotelgetal: N=
σt
Les 1
HPLC
- Hoge prestatie vloeistofchromatografie vroeger: hoge druk vloeistofchromatografie
- Buis met pakking stationaire fase
o Pakking bestaat uit silica
Niet-gemodificeerde silica = polair Normal-HPLC (N-HPLC)
Gemodificeerde silica = apolair Reversed Phase-HPLC (RP-HPLC)
Het omzetten van N-HPLC in RP-HPLC heet endcapping. Hierbij wordt
elke OH-groep omgezet in een niet-polaire groep
Er bestaan meerdere vormen van silica
Nadeel: bij een hoge pH zal er hydrolyse van de silicagel plaatsvinden,
waardoor het niet meer geschikt is voor HPLC
Dit kun je zien door snelle achteruitgang in efficiëntie, meer
piekverbreding en verhoging van de druk
- Doorstromen met vloeistof mobiele fase
o Bestaat meestal uit water, waterige bufferoplossing, water en organisch oplosmiddel
en mengsels van organische oplosmiddelen (vaak ook in gradiënt).
o Eluent moet van tevoren ontgast en gefiltreerd worden.
Ontgassing bijv. door doorstroming met helium
Voorkomt storingen aan de apparatuur
Ook de pomp moet stofvrij zijn.
- Stof verdeelt zich over mobiele en stationaire fase
o De stationaire fase vertraagt verschillende componenten
- Je wilt hoge schotelgetallen krijgen (>10000), dus lage schotelhoogtes kleine
deeltjesdiameter (dp) pakking nodig
L
o H=
N
H = schotelhoogte
N = schotelgetal
L = lengte kolom
o Om vloeistof toch er doorheen te krijgen, is er hoge (pomp)druk nodig.
- Apparatuur
, - Pomp
o Debiet (flow) F
F tussen 10 – 10000 μL/min
Zeer constant debiet nodig in verband met detectie
o Pmax = 40 MPA
o Diverse typen pompen beschikbaar
Twee pompen die onafhankelijk van elkaar werken binair pompsysteem
Nauwkeurige regeling van de twee oplosmiddelfracties
Zeswegkraan nodig duurder
- Injectiesysteem
o Zeswegkraan waarin een zogenaamde monsterlus is opgenomen
o Monsterkraan moet bestand zijn tegen hoge drukken en ‘dode’ ruimten moet
worden vermeden om extra piekverbreding te vermijden.
o Monster wordt hierin meteen vermengd met het oplosmiddel
- Kolom
o Eigenschappen
Roestvast staal
Lengte (L) 5-20 cm
Inwendige diameter 4-5 mm
Invloed verbinding kolom-detector op de uiteindelijke piekvorm
o De dode ruimten bij aansluitingen op de kolom moeten zo klein mogelijk zijn!
- Detector
o Tegenwoordig veelal gekoppeld aan UV-detector
Hoge gevoeligheid
Groot meetbereik
Vrij ongevoelig voor temperatuursveranderingen
o Computer maakt signaal zichtbaar
Wanneer pas je welke techniek toe?
- Vluchtig monster GC mogelijk
- Monster niet vluchtig (HP)LC mogelijk
- Grote moleculen GPC mogelijk
Wanneer HPLC toepassen
- Bij sterk polaire mengsels
- Hoge molecuulmassa’s
- Thermisch instabiele materialen
- Materialen met een neiging tot ionisatie
Formules zie formuleblad
∆ t R, j , i
- Resolutie: R j ,i=
2(σ t ¿ ¿ , j−σ t ,i) ¿
L
Retentietijd: t R , i= ( 1+k i ) =t R , 0 (1+k i)
' '
-
μ
( )
2
tR
- Schotelgetal: N=
σt
