Celfractionatie
Scheiden en zuiveren van cellen en celorganellen: inleiding
Zuiveren van cellen:
Centrifugatie op gradiënt
Immunomagnetische scheiding
Celsorting
Zuivering van celorganellen:
Homogenisatiemedium
Homogenisatietechnieken: mechanisch, enzymatisch, detergenten
Fractionatie cel- en weefselhomogenaat
Waarom? in primaire culturen en weefsels zitten meer dan 1 celtype, gemengde culturen laten niet
toe een effect aan 1 celtype toe te schrijven
Scheiden en zuiveren van cellen
Centrifugatie
Evenwichtsdichtheits- of gradiëntdichtsheids- of isopycnische centrifugatie
Scheiden van de componenten o.b.v. dichtheid
Dichtheidsgradiënten worden bekomen door verschillende lagen gradiënt media op elkaar te
plaatsen in een proefbuis
o Na centrifugatie: zwaarste laag onderaan, lichtste bovenaan
o Componenten uit de oplossing zinken naar beneden tot de positie wordt bereikt
waar de dichtheid van de omgevende vloeistof dezelfde is als die van de component
Als evenwicht wordt bereikt -> duur van centrifugatie heeft geen belang meer
Toepassing: lymfocyten
-> uit bloed kunnen 1-2 x 10^6 lymfocyten/ml worden opgezuiverd waarvan 98%
CD45+ (membraaneiwit dat als Ag dient op leukocyten) en bestaat uit T en B
lymfocyten
Immunomagnetische scheiding
Paramagnetische korrels (1-4,5 micrometer)
Oppervlaktelaag van de korrels bevat hydroxyl en epoxidegroepen voor covalent binden met
AL
Direct: primair AL van magneetkorrel bindt met specifiek AG in de cel
Indirect:
o Primair AL tegen specifiek AG in cel worden eerst op de cellen gebonden
o Magneetkorrels waarop secundaire AL zijn gebonden worden aan de cellen
toegevoegd
Cellen gebonden aan magneetkorrels door Ag-AL reactie worden gecollecteerd door
magneet aan de zijkant van celbevattend recipiënt te plaatsen
1
, Toepassing: isolatie van bepaald celtype, verwijderen van ongewenste cellen uit een mengsel
Flowcytometrie
= techniek die multiparametrische analyse van cellen of deeltjes toelaat terwijl ze in een
vloeistofstroom cel per cel doorheen een laserstraal passeren
Kenmerken van individuele cellen meten door hun interactie met laser
Cellen/deeltjes scheiden van elkaar
Opbouw
Fluïdum
Optisch systeem
Detectiesysteem
Celsortingssysteem
1. Single cell suspension
2. Aan cellen wordt een fluorochroom-geconjugeerd AL toegevoegd
3. Fluïdum systeem: staal vloeistofstroom waar de cellen opgelijnd worden zodat ze 1 voor
1 door het analyse/detectiepunt passeren (hydrodynamische focusering)
Hydrodynamische focusering:
-> deeltjesbevattendevloeistof wordt door cilinder gestuurd -> snelheidsgradiënt ontstaat bij
de deeltjes door wrijving t.h.v. de cilinderwand (viscous drag)
-> deeltjes worden naar centrum van vloeistofstroom gesleept (dragging)
4. Flow chamber: oplijning van cellen
-> 2 concentrisch vloeistofbevattende cilinders
2
Scheiden en zuiveren van cellen en celorganellen: inleiding
Zuiveren van cellen:
Centrifugatie op gradiënt
Immunomagnetische scheiding
Celsorting
Zuivering van celorganellen:
Homogenisatiemedium
Homogenisatietechnieken: mechanisch, enzymatisch, detergenten
Fractionatie cel- en weefselhomogenaat
Waarom? in primaire culturen en weefsels zitten meer dan 1 celtype, gemengde culturen laten niet
toe een effect aan 1 celtype toe te schrijven
Scheiden en zuiveren van cellen
Centrifugatie
Evenwichtsdichtheits- of gradiëntdichtsheids- of isopycnische centrifugatie
Scheiden van de componenten o.b.v. dichtheid
Dichtheidsgradiënten worden bekomen door verschillende lagen gradiënt media op elkaar te
plaatsen in een proefbuis
o Na centrifugatie: zwaarste laag onderaan, lichtste bovenaan
o Componenten uit de oplossing zinken naar beneden tot de positie wordt bereikt
waar de dichtheid van de omgevende vloeistof dezelfde is als die van de component
Als evenwicht wordt bereikt -> duur van centrifugatie heeft geen belang meer
Toepassing: lymfocyten
-> uit bloed kunnen 1-2 x 10^6 lymfocyten/ml worden opgezuiverd waarvan 98%
CD45+ (membraaneiwit dat als Ag dient op leukocyten) en bestaat uit T en B
lymfocyten
Immunomagnetische scheiding
Paramagnetische korrels (1-4,5 micrometer)
Oppervlaktelaag van de korrels bevat hydroxyl en epoxidegroepen voor covalent binden met
AL
Direct: primair AL van magneetkorrel bindt met specifiek AG in de cel
Indirect:
o Primair AL tegen specifiek AG in cel worden eerst op de cellen gebonden
o Magneetkorrels waarop secundaire AL zijn gebonden worden aan de cellen
toegevoegd
Cellen gebonden aan magneetkorrels door Ag-AL reactie worden gecollecteerd door
magneet aan de zijkant van celbevattend recipiënt te plaatsen
1
, Toepassing: isolatie van bepaald celtype, verwijderen van ongewenste cellen uit een mengsel
Flowcytometrie
= techniek die multiparametrische analyse van cellen of deeltjes toelaat terwijl ze in een
vloeistofstroom cel per cel doorheen een laserstraal passeren
Kenmerken van individuele cellen meten door hun interactie met laser
Cellen/deeltjes scheiden van elkaar
Opbouw
Fluïdum
Optisch systeem
Detectiesysteem
Celsortingssysteem
1. Single cell suspension
2. Aan cellen wordt een fluorochroom-geconjugeerd AL toegevoegd
3. Fluïdum systeem: staal vloeistofstroom waar de cellen opgelijnd worden zodat ze 1 voor
1 door het analyse/detectiepunt passeren (hydrodynamische focusering)
Hydrodynamische focusering:
-> deeltjesbevattendevloeistof wordt door cilinder gestuurd -> snelheidsgradiënt ontstaat bij
de deeltjes door wrijving t.h.v. de cilinderwand (viscous drag)
-> deeltjes worden naar centrum van vloeistofstroom gesleept (dragging)
4. Flow chamber: oplijning van cellen
-> 2 concentrisch vloeistofbevattende cilinders
2
