Vragen geïntegreerd practicum biochemie
Waarom gebruikt men kinetische methodes i.p.v. enzymatische bapelingen?
-> Bij enzymatische bepalingen kan er vanaf een bepaalde incubatieduur een afwijking optreden in
het lineaire verband tussen de hoeveelheid gevormd product en de incubatieduur t.g.v.
productinhibitie, terugreactie, eiwitdenaturatie. Daarom kan men enzymatische bepalingen kinetisch
uitvoeren: vorming van reactieproduct gevolgd door incubatie in een cuvet in de spectrofotometer.
Hieruit kan dan de absorptieverandering worden gemeten i.f.v. de tijd.
Voordeel: enkele minuten
Nadeel: hoge enzymactiviteit is nodig
Wat is een proteïne ladder?
-> gebruikt bij SDS page -> opgebouwd uit proteïnen met een gekend MW
Waarom moet men luchtbellen vermijden bij western blotting?
-> luchtbellen zorgen voor een plaats waar geen buffer kan zitten waardoor hier ook geen geleiding
mogelijk is
Hoe bewegen de proteïnen bij elektroforese?
-> van de cathode naar de anode dus van – naar +
Waarom gebruiken ze een weefselblanco?
-> Vermits de levercel wordt opengebroken, kunnen er nog andere factoren zijn die zorgen voor de
rode kleur. Niet alle rode kleur is te wijten aan SDH. Daarom stelt men een weefselblanco op waarbij
het substraat (wat zorgt voor activering van SDH) wordt vervangen door water. Hierdoor kan men de
aspecifieke vorming van TTC bepalen.
Resultaat: specifieke vorming van TTC = signaal SDH – signaal aspecifieke vorming TTC
Verschil tussen SDS page en agarose elektroforese?
Agarose gelelektroforese = natieve elektroforese
-> scheiding o.b.v. lading en grootte en o.b.v. mobiliteit in agarose gel
-> zowel denaturerende als niet-denaturerende technieken
-> vereist geen polymeriserend agens maar polymeriseert spontaan bij afkoelen van in oplossing
gebrachte agarosepoeder
-> structuur van het eiwit gaat niet verloren
Polyacrylamide gelelektroforese:
-> scheiding o.b.v. massa en lading
-> denaturatie van de eiwitten wordt voorafgegaan aan de elektroforetische scheiding
Waarom voegen we TEMED en ammoniumpersulfaat toe vlak voor het gieten van de
scheidingsgel?
-> ze induceren polymerisatie van de gel
Waarom geloplossing voorzichtig mengen?
-> lucht inhibeert de polymerisatie van acrylamide
Wat is de functie van de ladingsbuffer bij SDS page?
-> kleuring en verzwaring van het staal
-> zorgt ervoor dat de eiwitten in goede conformatie worden gebracht om te migreren door de gel
1
Waarom gebruikt men kinetische methodes i.p.v. enzymatische bapelingen?
-> Bij enzymatische bepalingen kan er vanaf een bepaalde incubatieduur een afwijking optreden in
het lineaire verband tussen de hoeveelheid gevormd product en de incubatieduur t.g.v.
productinhibitie, terugreactie, eiwitdenaturatie. Daarom kan men enzymatische bepalingen kinetisch
uitvoeren: vorming van reactieproduct gevolgd door incubatie in een cuvet in de spectrofotometer.
Hieruit kan dan de absorptieverandering worden gemeten i.f.v. de tijd.
Voordeel: enkele minuten
Nadeel: hoge enzymactiviteit is nodig
Wat is een proteïne ladder?
-> gebruikt bij SDS page -> opgebouwd uit proteïnen met een gekend MW
Waarom moet men luchtbellen vermijden bij western blotting?
-> luchtbellen zorgen voor een plaats waar geen buffer kan zitten waardoor hier ook geen geleiding
mogelijk is
Hoe bewegen de proteïnen bij elektroforese?
-> van de cathode naar de anode dus van – naar +
Waarom gebruiken ze een weefselblanco?
-> Vermits de levercel wordt opengebroken, kunnen er nog andere factoren zijn die zorgen voor de
rode kleur. Niet alle rode kleur is te wijten aan SDH. Daarom stelt men een weefselblanco op waarbij
het substraat (wat zorgt voor activering van SDH) wordt vervangen door water. Hierdoor kan men de
aspecifieke vorming van TTC bepalen.
Resultaat: specifieke vorming van TTC = signaal SDH – signaal aspecifieke vorming TTC
Verschil tussen SDS page en agarose elektroforese?
Agarose gelelektroforese = natieve elektroforese
-> scheiding o.b.v. lading en grootte en o.b.v. mobiliteit in agarose gel
-> zowel denaturerende als niet-denaturerende technieken
-> vereist geen polymeriserend agens maar polymeriseert spontaan bij afkoelen van in oplossing
gebrachte agarosepoeder
-> structuur van het eiwit gaat niet verloren
Polyacrylamide gelelektroforese:
-> scheiding o.b.v. massa en lading
-> denaturatie van de eiwitten wordt voorafgegaan aan de elektroforetische scheiding
Waarom voegen we TEMED en ammoniumpersulfaat toe vlak voor het gieten van de
scheidingsgel?
-> ze induceren polymerisatie van de gel
Waarom geloplossing voorzichtig mengen?
-> lucht inhibeert de polymerisatie van acrylamide
Wat is de functie van de ladingsbuffer bij SDS page?
-> kleuring en verzwaring van het staal
-> zorgt ervoor dat de eiwitten in goede conformatie worden gebracht om te migreren door de gel
1
