Scheidingstechnieken
Inhoudsopgave
Afkortingen .................................................................................................................................................... 3
Algemene principe in chromatografie ............................................................................................................. 3
Destillatie en het begrip H.E.T.P ......................................................................................................................... 4
Inleiding chromatografie .................................................................................................................................... 5
Chromatografische parameters.......................................................................................................................... 6
Aantal theoretische platen N ......................................................................................................................... 6
H.E.T.P ............................................................................................................................................................ 6
Retentietijd .................................................................................................................................................... 6
Resolutie ........................................................................................................................................................ 6
Optimalisatie chromatografie ........................................................................................................................ 6
Berekening van parameters ........................................................................................................................... 6
De van deemter vergelijking .......................................................................................................................... 7
High performance liquid chromatography ...................................................................................................... 7
Inleiding .............................................................................................................................................................. 7
Scheidingsprincipes in de chromatografie ....................................................................................................... 8
Inleiding .............................................................................................................................................................. 8
Adsorptiechromatografie ................................................................................................................................... 8
Adsorbens ...................................................................................................................................................... 8
Mobiele fase .................................................................................................................................................. 9
Toepassingen ................................................................................................................................................. 9
Verdelingschromatografie .................................................................................................................................. 9
Reverse phase chromatografie ...................................................................................................................... 9
Straight phase chromatografie ...................................................................................................................... 9
Toepassingen ............................................................................................................................................... 10
Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) .................................................................................................. 10
Gelpermeatiechromatografie (GPC) ................................................................................................................. 10
De matrix ..................................................................................................................................................... 10
De elutie....................................................................................................................................................... 11
Toepassing ................................................................................................................................................... 11
Ion chromatografie (IC) .................................................................................................................................... 11
Stationaire fase ............................................................................................................................................ 11
De elutie....................................................................................................................................................... 12
De procedure ............................................................................................................................................... 13
Ionparingschromatografie ........................................................................................................................... 13
Toepassingen ............................................................................................................................................... 13
Affiniteitschromatografie ................................................................................................................................. 14
Matrix en ligand ........................................................................................................................................... 14
Combineren van technieken ............................................................................................................................. 14
Gaschromatografie ....................................................................................................................................... 15
, Inleiding ............................................................................................................................................................ 15
Apparatuur ....................................................................................................................................................... 15
Draaggas ...................................................................................................................................................... 15
Injectiepoort ................................................................................................................................................ 15
Kolom ........................................................................................................................................................... 17
Thermostaat ................................................................................................................................................ 18
Detector ....................................................................................................................................................... 19
Dataverwerkingssysteem ............................................................................................................................. 20
Toepassingen .................................................................................................................................................... 20
Methodeontwikkeling en berekeningen ....................................................................................................... 20
Methodeontwikkeling ....................................................................................................................................... 20
Standaarden................................................................................................................................................. 20
Mehodeblanco ............................................................................................................................................. 20
Controlestandaard ....................................................................................................................................... 20
Calibratiestandaard ..................................................................................................................................... 20
Stalen ........................................................................................................................................................... 20
Validatie van analysemethoden................................................................................................................... 21
Kwalitatieve analyse .................................................................................................................................... 21
Berekeningen .................................................................................................................................................... 21
100% - methode zonder responsfactor ....................................................................................................... 21
100% - methode met responsfactor ............................................................................................................ 21
Externe standaardmethode ......................................................................................................................... 22
Interne standaardmethode ......................................................................................................................... 22
,Afkortingen
H.E.T.P.: Hoogte equivalent theoretische platen
Qx: recovery van component X
CCD: counter current distribution
LC: liquid chromatografie
GC: gaschromatografie
HPLC: high performance liquid chromatografie
ELSD: evaporative light scattering detector
ECD: elektrochemische detector
RP: reverse phase
CC: concentrating column
LSG: liquid-solid chromatography
GSC: gas-solid chromatography
TLC: thin layer chromatography
HPTLC: high performance thin layer chromatografie
DMCS: dimethylchloorsilaan
HIC: hydrofobe interactie chromatografie
GPC: gelpermeatiechromatografie
SEC: size exclusion chromatography
DNA: deoxyribonucleïnezuur
RNA: ribonucleïnezuur
HMW: hoogmoleculair gewicht
LMW: laagmoleculair gewicht
IEC: ion exchange chromatography
IPC: ion paringschromatography
IMAC: geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie.
Algemene principe in chromatografie
- Een scheiding op basis van een bepaalde fysische of chemische eigenschap is
moeilijk. Want deze eigenschappen zijn zelden specifiek, stoffen met gelijkaardige
eigenschappen zorgen voor interferentie en dienen uitgeschakeld te worden.
o immobilisatie van interferentie of fysische scheiding van de interfererende
stoffen door filtratie, extractie, destillatie en/of chromatografie
- Scheidingsprocedures streven naar:
o snelle scheiding en analyse
o scherpe scheiding en nauwkeurige analyse
o aantonen en bepalen van micro- en ultramicro hoeveelheden
o automatisering
- De scheiding is efficiënt als er een evenwichtsinstelling gebeurt en het aantal
evenwichtsinstellingen groter is.
- Verdelingscoëffinient: hoe twee componenten zich verdelen over 2 fases.
o De fractioneeringstechniek: verdeling tussen de twee fasen gebeurt vaker en
over geheel nieuwe porties van de twee fases.
, - De recovery van een kolom moet optimaal zijn, deze wordt uit gedrukt in de
volgende formule:
o Voor een hoge
recovery moet Qy
klein zijn en Qx
groot.
- De relatieve onzekerheid
is R. O = (M-Mo)/Mo maar
kan herleid worden naar
R.O= Qx - 1) + [(ky.yo)/ (kx.xo)].Qy.
Bewijs
o M = Mx+My
o Mo = Kx.Xo
o My= ky.Y en Mx= kx.X
!"!#
o 𝑅. 𝑂 = !#
(!%&!')"!#
o R. O = !#
()%.+&)'.,)"()%.+#)
o R. O = (-../0)
()%.(1%.+#)&)'.(1'.,#))"()%.+#)
o R. O = (-../0)
()%.(1%.+#)&)'.(1'.,#))"()%.+#)
o R. O = (-../0)
)'.,#
o R. O = (Qx − 1). (-../0) . 𝑄𝑦
Destillatie en het begrip H.E.T.P
- Hoe groter het inwendige oppervlak hoe beter het contact tussen het
terugstromende vloeistof en de opstijgende damp en hoe beter de scheiding.
- Hoe meer schotels in een kolom, hoe beter de scheiding.
o Het aantal schotels is een maat voor het scheidend vermogen van een kolom.
o Op elke schotel vindt er uitwisseling plaats tussen het terugstromende
vloeistof en de opstijgende damp.
o Maar als het aantal schotels te hoog is kan er ‘hold up’ optreden, waardoor
de evenwichtstelling trager gebeurt.
- Theoretische plaat?
o De plaats waar er evenwicht kan plaats vinden, als er genoeg tijd verstreken
is.
§ H.E.T.P: deze moet klein zijn, zo zijn er meer platen per kolomeenheid
en is de scheiding beter.
, Inleiding chromatografie
Wat is chromatografie?
- Bestanddelen verdelen zich er
herhaaldelijk over twee fasen.
Een mengsel wordt
aangebracht op een stationaire
fase en wordt dan
meegenomen door een
mobiele fase. De verdeling
tussen de twee fasen is
afhankelijk van de affiniteit.
o Affiniteit eluens-> vluchtig-> als eerste uit de kolom
o Affiniteit stationaire fase-> bepaalt het absorptie vermogen-> komt als laatste
eruit
- De elutie snelheid is afhankelijk van de affiniteit van het bestanddeel voor de eluens
en/of stationaire fase.
De chromatografische scheidingen zijn gebaseerd op het verdelen van bestanddelen over
(2)34.5637
twee fasen, dit wordt uitgedrukt in K. De verdelingsconstante: 𝐾 = (8)9#:.;<=>.
o K moet zo klein mogelijk zijn om een sneller elutie te hebben.
o K is constant bij een bepaalde T en een lage concentratie aan analyt.
Wat is elutie?
- De uitwisseling van de bestanddelen uit de kolom door de toevoeging van een
overmaat aan nieuw solvent.
Hoe kan de scheiding gedetecteerd worden?
- Met behulp van een fractiecollector waarbij het signaal van het opgevangen solvent
wordt omgezet i.f.v. tijd of volume.
Hoe kan een chromatogram afgelezen worden?
- De plaats van een piek geeft informatie over welk bestanddeel er aanwezig is (=
kwalitatieve analyse) en de oppervlakte van deze piek geeft aanduiding over de
concentratie van dat bestanddeel (= kwantitatieve analyse).
- De V0 of t0 geeft respectievelijk het volume of de tijd weer dat het solvent nodig
heeft om door de kolom te elueren. Dit si het dood column of de dode tijd.
Inhoudsopgave
Afkortingen .................................................................................................................................................... 3
Algemene principe in chromatografie ............................................................................................................. 3
Destillatie en het begrip H.E.T.P ......................................................................................................................... 4
Inleiding chromatografie .................................................................................................................................... 5
Chromatografische parameters.......................................................................................................................... 6
Aantal theoretische platen N ......................................................................................................................... 6
H.E.T.P ............................................................................................................................................................ 6
Retentietijd .................................................................................................................................................... 6
Resolutie ........................................................................................................................................................ 6
Optimalisatie chromatografie ........................................................................................................................ 6
Berekening van parameters ........................................................................................................................... 6
De van deemter vergelijking .......................................................................................................................... 7
High performance liquid chromatography ...................................................................................................... 7
Inleiding .............................................................................................................................................................. 7
Scheidingsprincipes in de chromatografie ....................................................................................................... 8
Inleiding .............................................................................................................................................................. 8
Adsorptiechromatografie ................................................................................................................................... 8
Adsorbens ...................................................................................................................................................... 8
Mobiele fase .................................................................................................................................................. 9
Toepassingen ................................................................................................................................................. 9
Verdelingschromatografie .................................................................................................................................. 9
Reverse phase chromatografie ...................................................................................................................... 9
Straight phase chromatografie ...................................................................................................................... 9
Toepassingen ............................................................................................................................................... 10
Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) .................................................................................................. 10
Gelpermeatiechromatografie (GPC) ................................................................................................................. 10
De matrix ..................................................................................................................................................... 10
De elutie....................................................................................................................................................... 11
Toepassing ................................................................................................................................................... 11
Ion chromatografie (IC) .................................................................................................................................... 11
Stationaire fase ............................................................................................................................................ 11
De elutie....................................................................................................................................................... 12
De procedure ............................................................................................................................................... 13
Ionparingschromatografie ........................................................................................................................... 13
Toepassingen ............................................................................................................................................... 13
Affiniteitschromatografie ................................................................................................................................. 14
Matrix en ligand ........................................................................................................................................... 14
Combineren van technieken ............................................................................................................................. 14
Gaschromatografie ....................................................................................................................................... 15
, Inleiding ............................................................................................................................................................ 15
Apparatuur ....................................................................................................................................................... 15
Draaggas ...................................................................................................................................................... 15
Injectiepoort ................................................................................................................................................ 15
Kolom ........................................................................................................................................................... 17
Thermostaat ................................................................................................................................................ 18
Detector ....................................................................................................................................................... 19
Dataverwerkingssysteem ............................................................................................................................. 20
Toepassingen .................................................................................................................................................... 20
Methodeontwikkeling en berekeningen ....................................................................................................... 20
Methodeontwikkeling ....................................................................................................................................... 20
Standaarden................................................................................................................................................. 20
Mehodeblanco ............................................................................................................................................. 20
Controlestandaard ....................................................................................................................................... 20
Calibratiestandaard ..................................................................................................................................... 20
Stalen ........................................................................................................................................................... 20
Validatie van analysemethoden................................................................................................................... 21
Kwalitatieve analyse .................................................................................................................................... 21
Berekeningen .................................................................................................................................................... 21
100% - methode zonder responsfactor ....................................................................................................... 21
100% - methode met responsfactor ............................................................................................................ 21
Externe standaardmethode ......................................................................................................................... 22
Interne standaardmethode ......................................................................................................................... 22
,Afkortingen
H.E.T.P.: Hoogte equivalent theoretische platen
Qx: recovery van component X
CCD: counter current distribution
LC: liquid chromatografie
GC: gaschromatografie
HPLC: high performance liquid chromatografie
ELSD: evaporative light scattering detector
ECD: elektrochemische detector
RP: reverse phase
CC: concentrating column
LSG: liquid-solid chromatography
GSC: gas-solid chromatography
TLC: thin layer chromatography
HPTLC: high performance thin layer chromatografie
DMCS: dimethylchloorsilaan
HIC: hydrofobe interactie chromatografie
GPC: gelpermeatiechromatografie
SEC: size exclusion chromatography
DNA: deoxyribonucleïnezuur
RNA: ribonucleïnezuur
HMW: hoogmoleculair gewicht
LMW: laagmoleculair gewicht
IEC: ion exchange chromatography
IPC: ion paringschromatography
IMAC: geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie.
Algemene principe in chromatografie
- Een scheiding op basis van een bepaalde fysische of chemische eigenschap is
moeilijk. Want deze eigenschappen zijn zelden specifiek, stoffen met gelijkaardige
eigenschappen zorgen voor interferentie en dienen uitgeschakeld te worden.
o immobilisatie van interferentie of fysische scheiding van de interfererende
stoffen door filtratie, extractie, destillatie en/of chromatografie
- Scheidingsprocedures streven naar:
o snelle scheiding en analyse
o scherpe scheiding en nauwkeurige analyse
o aantonen en bepalen van micro- en ultramicro hoeveelheden
o automatisering
- De scheiding is efficiënt als er een evenwichtsinstelling gebeurt en het aantal
evenwichtsinstellingen groter is.
- Verdelingscoëffinient: hoe twee componenten zich verdelen over 2 fases.
o De fractioneeringstechniek: verdeling tussen de twee fasen gebeurt vaker en
over geheel nieuwe porties van de twee fases.
, - De recovery van een kolom moet optimaal zijn, deze wordt uit gedrukt in de
volgende formule:
o Voor een hoge
recovery moet Qy
klein zijn en Qx
groot.
- De relatieve onzekerheid
is R. O = (M-Mo)/Mo maar
kan herleid worden naar
R.O= Qx - 1) + [(ky.yo)/ (kx.xo)].Qy.
Bewijs
o M = Mx+My
o Mo = Kx.Xo
o My= ky.Y en Mx= kx.X
!"!#
o 𝑅. 𝑂 = !#
(!%&!')"!#
o R. O = !#
()%.+&)'.,)"()%.+#)
o R. O = (-../0)
()%.(1%.+#)&)'.(1'.,#))"()%.+#)
o R. O = (-../0)
()%.(1%.+#)&)'.(1'.,#))"()%.+#)
o R. O = (-../0)
)'.,#
o R. O = (Qx − 1). (-../0) . 𝑄𝑦
Destillatie en het begrip H.E.T.P
- Hoe groter het inwendige oppervlak hoe beter het contact tussen het
terugstromende vloeistof en de opstijgende damp en hoe beter de scheiding.
- Hoe meer schotels in een kolom, hoe beter de scheiding.
o Het aantal schotels is een maat voor het scheidend vermogen van een kolom.
o Op elke schotel vindt er uitwisseling plaats tussen het terugstromende
vloeistof en de opstijgende damp.
o Maar als het aantal schotels te hoog is kan er ‘hold up’ optreden, waardoor
de evenwichtstelling trager gebeurt.
- Theoretische plaat?
o De plaats waar er evenwicht kan plaats vinden, als er genoeg tijd verstreken
is.
§ H.E.T.P: deze moet klein zijn, zo zijn er meer platen per kolomeenheid
en is de scheiding beter.
, Inleiding chromatografie
Wat is chromatografie?
- Bestanddelen verdelen zich er
herhaaldelijk over twee fasen.
Een mengsel wordt
aangebracht op een stationaire
fase en wordt dan
meegenomen door een
mobiele fase. De verdeling
tussen de twee fasen is
afhankelijk van de affiniteit.
o Affiniteit eluens-> vluchtig-> als eerste uit de kolom
o Affiniteit stationaire fase-> bepaalt het absorptie vermogen-> komt als laatste
eruit
- De elutie snelheid is afhankelijk van de affiniteit van het bestanddeel voor de eluens
en/of stationaire fase.
De chromatografische scheidingen zijn gebaseerd op het verdelen van bestanddelen over
(2)34.5637
twee fasen, dit wordt uitgedrukt in K. De verdelingsconstante: 𝐾 = (8)9#:.;<=>.
o K moet zo klein mogelijk zijn om een sneller elutie te hebben.
o K is constant bij een bepaalde T en een lage concentratie aan analyt.
Wat is elutie?
- De uitwisseling van de bestanddelen uit de kolom door de toevoeging van een
overmaat aan nieuw solvent.
Hoe kan de scheiding gedetecteerd worden?
- Met behulp van een fractiecollector waarbij het signaal van het opgevangen solvent
wordt omgezet i.f.v. tijd of volume.
Hoe kan een chromatogram afgelezen worden?
- De plaats van een piek geeft informatie over welk bestanddeel er aanwezig is (=
kwalitatieve analyse) en de oppervlakte van deze piek geeft aanduiding over de
concentratie van dat bestanddeel (= kwantitatieve analyse).
- De V0 of t0 geeft respectievelijk het volume of de tijd weer dat het solvent nodig
heeft om door de kolom te elueren. Dit si het dood column of de dode tijd.
