Histologie — Antwoorden Examenvragen
1e Bachelor Biomedische Wetenschappen
VRAAG 1: Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Uitleg: De lichtmicroscoop (LM) gebruikt zichtbaar licht (400-700 nm) met een resolutie van ca. 0,2
µm, waardoor weefselarchitectuur, celtypen, kernen en histochemische reacties bestudeerd kunnen
worden tot vergrotingen van ~1000×. De transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) gebruikt
versnelde elektronen (golflengte ~0,004 nm) met een praktische resolutie van 0,2-2 nm, waardoor
ultrastructuren zoals membranen (7 nm), ribosomen, mitochondria-cristae en moleculaire
lokalisatie via immunogoldlabeling zichtbaar worden tot vergrotingen van 1.000.000×. Voor LM
wordt weefsel gefixeerd in 4% formaldehyde, gedehydrateerd via een stijgende alcoholreeks,
ingeklaard in xyleen, ingebed in paraffine en gesneden op 5-10 µm; daarna volgt deparaffinering en
kleuring. Voor TEM is optimale fixatie met glutaaraldehyde (bifunctioneel, stevigere cross-links)
gevolgd door post-fixatie met osmiumtetroxide (OsO4, fixeert en contrasteert membraanlipoïden)
vereist, waarna het weefsel in epoxyhars wordt ingebed en op een ultramicrotoom in coupes van
50-100 nm gesneden wordt. Formaldehyde penetreert snel maar maakt minder stevige cross-links
en volstaat voor LM; glutaaraldehyde penetreert trager maar fixeert de ultrastructuur zo
nauwkeurig dat zelfs lichte osmotische zwelling van mitochondria zichtbaar zou zijn, vandaar ook
de vereiste van kleine stukjes (max 1-2 mm) en directe fixatie op 4°C.
,VRAAG 2: Bespreek de "fixatie" aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Uitleg: Fixatie beoogt het weefsel chemisch te stabiliseren zodat de oorspronkelijke structuur
maximaal bewaard blijft; zonder fixatie treden autolyse en bacteriële vertering op binnen minuten
na circulatiestop. Beide fixatieven werken via cross-linking: ze vormen covalente bindingen met
vrije aminogroepen (NH2, vnl. lysineresiduen) van eiwitten. Formaldehyde (HCHO, monoaldehyde)
reageert met aminogroepen en vormt methyleen-bruggen (-CH2-); omdat slechts één aldehyde-
groep aanwezig is, zijn de cross-links minder stabiel. Glutaaraldehyde (OHC-(CH2)3-CHO,
dialdehyde) bezit twee reactieve aldehydegroepen en kan zo twee eiwitten tegelijk koppelen, wat
stevigere en meer permanente cross-links oplevert. Voor lichtmicroscopie (LM) wordt
formaldehyde (4% formaline) gebruikt: het penetreert snel, is geschikt voor grotere weefselstukken
en volstaat voor de resolutie van LM. Voor elektronenmicroscopie (EM) is glutaaraldehyde
noodzakelijk omdat de hogere resolutie iedere ultrastructurele verstoring zichtbaar maakt; na
glutaaraldehyde volgt een post-fixatie met osmiumtetroxide (OsO4), dat membraanlipoïden fixeert
en contrasteert door oxidatie van onverzadigde vetzuren. Immunohistochemie op paraffine
gebruikt formaldehyde (met hitteinductie van antigenen indien nodig); TEM, SEM en aanverwante
elektronenmicroscopische technieken vereisen glutaaraldehyde gevolgd door OsO4.
VRAAG 3: Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er
gebruik gemaakt van directe, indirecte en ge-amplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Uitleg: Immunohistochemie (IHC) is een techniek waarbij antilichamen specifiek binden aan een
doelwit-antigeen (eiwit, koolhydraat of lipide) in weefselcoupes, waarna de binding zichtbaar wordt
gemaakt via een enzymreactie (bijv. HRP + DAB → bruin neerslag) of fluorochroom. Bij de directe
methode is het primaire antilichaam zelf geconjugeerd met het label; dit is eenvoudig maar weinig
gevoelig. Bij de indirecte methode bindt eerst een ongelabeld primair antilichaam aan het antigeen,
waarna een gelabeld secundair antilichaam het Fc-fragment van het primaire herkent; meerdere
secundaire antilichamen kunnen binden, wat het signaal amplificeeert en de gevoeligheid verhoogt.
De ge-amplificeerde ABC-methode (avidin-biotine-complex) benut de quasi-irreversibele binding
tussen avidine en biotine (Kd ~10⁻¹⁵ mol/L): een biotine-geconjugeerd secundair antilichaam bindt
aan een voorgevormd avidine-biotine-enzymcomplex, wat de gevoeligheid sterk verhoogt.
Immunofluorescentie vervangt enzymreacties door fluorochromen (FITC groen, rhodamine rood,
DAPI blauw), wat meervoudige gelijktijdige labeling mogelijk maakt maar een
,fluorescentiemicroscoop vereist. Deze methoden bestaan naast elkaar omdat niet alle antigenen in
hoge concentratie aanwezig zijn, sommige weefseltypen achtergrondruis geven of specifieke
antigeenonthulling (hitteinductie) vereisen, en het compromis tussen gevoeligheid, specificiteit en
praktische toepasbaarheid per toepassing verschilt.
VRAAG 4: Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
Uitleg: Na chirurgische resectie begint onmiddellijk autolyse; het weefsel wordt daarom zo snel
mogelijk ondergedompeld in 4% formaldehyde (fixatie, 2-24 uur), dat via cross-linking de
moleculaire structuur stabiliseert en autolyse en bacteriële afbraak stopt. De patholoog inspecteert
het preparaat macroscopisch en snijdt representatieve stukjes uit voor microscopisch onderzoek.
Omdat paraffine niet mengbaar is met water, wordt het weefsel gedehydrateerd via een stijgende
alcoholreeks (50-100% ethanol), waarna alcohol wordt vervangen door xyleen (inklaring).
Vervolgens wordt het weefsel gedrenkt in vloeibare paraffine (60°C) die na afkoeling stolt tot een
hard blok; op een microtoom worden coupes van 5-10 µm gesneden, uitgevlakt op een waterbad en
op een objectglaasje gebracht. Vóór kleuring moet paraffine worden verwijderd (deparaffinering via
xyleen en dalende alcoholreeks naar water). De standaard HE-kleuring kleurt kernen blauw-paars
(haematoxyline, basofiel) en cytoplasma/ECM roze (eosine, eosinofiel); andere kleuringen worden
naar behoefte toegevoegd. Na kleuring volgen opnieuw dehydratatie, inklaring en het aanbrengen
van een dekglaasje. Als alternatief voor snelle peroperatieve diagnostiek wordt weefsel ingevroren
in OCT-medium bij -150°C en direct gesneden op een vriesmicrotoom (~10-15 min totaal).
VRAAG 5: Geef een overzicht van de verschillende types kleuringen die courant gebruikt
worden in de histologie? Leg kort principe en doel van de diverse types kleuringen uit. Met
welke methode zou je een delende cel kunnen identificeren?
Uitleg: In de histologie worden diverse kleuringstypes gebruikt. De haematoxyline-eosine (HE) is de
standaardkleuring: haematoxyline kleurt negatief geladen structuren (DNA, RNA, ribosomen)
blauw-paars en eosine kleurt positief geladen structuren (cytoplasmatische eiwitten, collageen)
roze-rood. Empirische kleuringen zoals de Masson-trichroomkleuring (collageen blauw/groen,
spier rood, kern zwart) en zilverimpregnatie (reticulaire vezels zwart, argyrofiel) zijn ontdekt door
trial-and-error. Histochemische kleuringen berusten op een specifieke chemische reactie: de PAS-
kleuring (Periodic Acid-Schiff) oxideert glycolgroepen in polysacchariden en mucines tot aldehyden
die met Schiff-reagens magenta kleuren; dit visualiseert glycogeen, mucus en basaalmembranen.
, Enzymhistochemische kleuringen benutten de eigen enzymatische activiteit van het weefsel: het
enzym zet een substraat om tot een zichtbaar gekleurde neerslag ter plaatse van activiteit, waarvoor
vriescoupes vereist zijn (enzymen zijn niet actief na paraffine-inbedding). Immunohistochemische
kleuringen (IHC) gebruiken specifieke antilichamen om eiwitten te detecteren via enzymreactie
(DAB, bruin) of fluorochroom. Een delende cel kan worden geïdentificeerd met IHC tegen Ki-67
(nucleair proliferatiemarker aanwezig in alle actieve fases van de celcyclus, afwezig in G0) of via
zichtbare mitotische figuren (condensed chromosomen, spoelfiguur) op standaard HE.
VRAAG 6: Bespreek 3 toepassingen van immunohistochemie en hoe deze kunnen helpen bij
pathologische diagnostiek.
Uitleg: Immunohistochemie heeft drie belangrijke klinische toepassingen in de pathologische
diagnostiek. Ten eerste de tumorclassificatie en bepaling van tumoroorsprong: bij metastase naar
een onbekende locatie bepalen weefselspecifieke markers de herkomst van de primaire tumor.
Cytokeratines (CK) zijn aanwezig in epitheelcellen en positief bij carcinomen (het patroon
CK7+/CK20- wijst op longcarcinoom, CK7-/CK20+ op colorectaal carcinoom); vimentine is positief
bij sarcomen; LCA (leukocyt common antigen) bij lymfomen; S100/HMB45 bij melanoom. Ten
tweede de bepaling van prognose en behandelrespons via receptorstatus: bij borstkanker bepalen
ER (oestrogeenreceptor), PR (progesteronreceptor) en HER2 de therapiekeuze; ER+/PR+ tumoren
reageren op hormonale therapie (tamoxifen), HER2-overexpressie op trastuzumab. De proliferatie-
index Ki-67 geeft aan welk percentage cellen actief deelt en voorspelt de agressiviteit. Ten derde de
detectie van infectieuze agenten en prognostische markers: virussen zoals HPV, CMV en EBV
kunnen in weefsel worden aangetoond met specifieke antilichamen, wat therapie en prognose
stuurt. IHC is zo onmisbaar in de moderne pathologie voor zowel tumorclassificatie als
therapieselectie.
VRAAG 7: Bespreek het principe van scanning electronenmicroscopie (SEM). Wat kan je met
deze methode bestuderen?
Uitleg: Bij scanning-elektronenmicroscopie (SEM) wordt een fijne primaire elektronenbundel,
afkomstig van een elektronenkanon, systematisch over het oppervlak van het preparaat geleid door
elektromagnetische lensjes en scanning-spoelen. Wanneer de primaire elektronen het oppervlak
raken, komen secundaire elektronen vrij (energie <50 eV) die enkel uit de bovenste nanometers van
het oppervlak ontsnappen; de intensiteit is afhankelijk van de hellingshoek en topografie, wat een
driedimensionaal beeld oplevert. Een detector (Everhart-Thornley detector) registreert deze
secundaire elektronen en een computer assembleert het beeld pixel per pixel. Terugverstrooide
elektronen (BSE, hogere energie) geven aanvullend informatie over de elementaire samenstelling.
Vergrotingen tot 100.000× zijn mogelijk met een resolutie van 1-5 nm. Preparaatvoorbereiding
1e Bachelor Biomedische Wetenschappen
VRAAG 1: Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Uitleg: De lichtmicroscoop (LM) gebruikt zichtbaar licht (400-700 nm) met een resolutie van ca. 0,2
µm, waardoor weefselarchitectuur, celtypen, kernen en histochemische reacties bestudeerd kunnen
worden tot vergrotingen van ~1000×. De transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) gebruikt
versnelde elektronen (golflengte ~0,004 nm) met een praktische resolutie van 0,2-2 nm, waardoor
ultrastructuren zoals membranen (7 nm), ribosomen, mitochondria-cristae en moleculaire
lokalisatie via immunogoldlabeling zichtbaar worden tot vergrotingen van 1.000.000×. Voor LM
wordt weefsel gefixeerd in 4% formaldehyde, gedehydrateerd via een stijgende alcoholreeks,
ingeklaard in xyleen, ingebed in paraffine en gesneden op 5-10 µm; daarna volgt deparaffinering en
kleuring. Voor TEM is optimale fixatie met glutaaraldehyde (bifunctioneel, stevigere cross-links)
gevolgd door post-fixatie met osmiumtetroxide (OsO4, fixeert en contrasteert membraanlipoïden)
vereist, waarna het weefsel in epoxyhars wordt ingebed en op een ultramicrotoom in coupes van
50-100 nm gesneden wordt. Formaldehyde penetreert snel maar maakt minder stevige cross-links
en volstaat voor LM; glutaaraldehyde penetreert trager maar fixeert de ultrastructuur zo
nauwkeurig dat zelfs lichte osmotische zwelling van mitochondria zichtbaar zou zijn, vandaar ook
de vereiste van kleine stukjes (max 1-2 mm) en directe fixatie op 4°C.
,VRAAG 2: Bespreek de "fixatie" aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Uitleg: Fixatie beoogt het weefsel chemisch te stabiliseren zodat de oorspronkelijke structuur
maximaal bewaard blijft; zonder fixatie treden autolyse en bacteriële vertering op binnen minuten
na circulatiestop. Beide fixatieven werken via cross-linking: ze vormen covalente bindingen met
vrije aminogroepen (NH2, vnl. lysineresiduen) van eiwitten. Formaldehyde (HCHO, monoaldehyde)
reageert met aminogroepen en vormt methyleen-bruggen (-CH2-); omdat slechts één aldehyde-
groep aanwezig is, zijn de cross-links minder stabiel. Glutaaraldehyde (OHC-(CH2)3-CHO,
dialdehyde) bezit twee reactieve aldehydegroepen en kan zo twee eiwitten tegelijk koppelen, wat
stevigere en meer permanente cross-links oplevert. Voor lichtmicroscopie (LM) wordt
formaldehyde (4% formaline) gebruikt: het penetreert snel, is geschikt voor grotere weefselstukken
en volstaat voor de resolutie van LM. Voor elektronenmicroscopie (EM) is glutaaraldehyde
noodzakelijk omdat de hogere resolutie iedere ultrastructurele verstoring zichtbaar maakt; na
glutaaraldehyde volgt een post-fixatie met osmiumtetroxide (OsO4), dat membraanlipoïden fixeert
en contrasteert door oxidatie van onverzadigde vetzuren. Immunohistochemie op paraffine
gebruikt formaldehyde (met hitteinductie van antigenen indien nodig); TEM, SEM en aanverwante
elektronenmicroscopische technieken vereisen glutaaraldehyde gevolgd door OsO4.
VRAAG 3: Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er
gebruik gemaakt van directe, indirecte en ge-amplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Uitleg: Immunohistochemie (IHC) is een techniek waarbij antilichamen specifiek binden aan een
doelwit-antigeen (eiwit, koolhydraat of lipide) in weefselcoupes, waarna de binding zichtbaar wordt
gemaakt via een enzymreactie (bijv. HRP + DAB → bruin neerslag) of fluorochroom. Bij de directe
methode is het primaire antilichaam zelf geconjugeerd met het label; dit is eenvoudig maar weinig
gevoelig. Bij de indirecte methode bindt eerst een ongelabeld primair antilichaam aan het antigeen,
waarna een gelabeld secundair antilichaam het Fc-fragment van het primaire herkent; meerdere
secundaire antilichamen kunnen binden, wat het signaal amplificeeert en de gevoeligheid verhoogt.
De ge-amplificeerde ABC-methode (avidin-biotine-complex) benut de quasi-irreversibele binding
tussen avidine en biotine (Kd ~10⁻¹⁵ mol/L): een biotine-geconjugeerd secundair antilichaam bindt
aan een voorgevormd avidine-biotine-enzymcomplex, wat de gevoeligheid sterk verhoogt.
Immunofluorescentie vervangt enzymreacties door fluorochromen (FITC groen, rhodamine rood,
DAPI blauw), wat meervoudige gelijktijdige labeling mogelijk maakt maar een
,fluorescentiemicroscoop vereist. Deze methoden bestaan naast elkaar omdat niet alle antigenen in
hoge concentratie aanwezig zijn, sommige weefseltypen achtergrondruis geven of specifieke
antigeenonthulling (hitteinductie) vereisen, en het compromis tussen gevoeligheid, specificiteit en
praktische toepasbaarheid per toepassing verschilt.
VRAAG 4: Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
Uitleg: Na chirurgische resectie begint onmiddellijk autolyse; het weefsel wordt daarom zo snel
mogelijk ondergedompeld in 4% formaldehyde (fixatie, 2-24 uur), dat via cross-linking de
moleculaire structuur stabiliseert en autolyse en bacteriële afbraak stopt. De patholoog inspecteert
het preparaat macroscopisch en snijdt representatieve stukjes uit voor microscopisch onderzoek.
Omdat paraffine niet mengbaar is met water, wordt het weefsel gedehydrateerd via een stijgende
alcoholreeks (50-100% ethanol), waarna alcohol wordt vervangen door xyleen (inklaring).
Vervolgens wordt het weefsel gedrenkt in vloeibare paraffine (60°C) die na afkoeling stolt tot een
hard blok; op een microtoom worden coupes van 5-10 µm gesneden, uitgevlakt op een waterbad en
op een objectglaasje gebracht. Vóór kleuring moet paraffine worden verwijderd (deparaffinering via
xyleen en dalende alcoholreeks naar water). De standaard HE-kleuring kleurt kernen blauw-paars
(haematoxyline, basofiel) en cytoplasma/ECM roze (eosine, eosinofiel); andere kleuringen worden
naar behoefte toegevoegd. Na kleuring volgen opnieuw dehydratatie, inklaring en het aanbrengen
van een dekglaasje. Als alternatief voor snelle peroperatieve diagnostiek wordt weefsel ingevroren
in OCT-medium bij -150°C en direct gesneden op een vriesmicrotoom (~10-15 min totaal).
VRAAG 5: Geef een overzicht van de verschillende types kleuringen die courant gebruikt
worden in de histologie? Leg kort principe en doel van de diverse types kleuringen uit. Met
welke methode zou je een delende cel kunnen identificeren?
Uitleg: In de histologie worden diverse kleuringstypes gebruikt. De haematoxyline-eosine (HE) is de
standaardkleuring: haematoxyline kleurt negatief geladen structuren (DNA, RNA, ribosomen)
blauw-paars en eosine kleurt positief geladen structuren (cytoplasmatische eiwitten, collageen)
roze-rood. Empirische kleuringen zoals de Masson-trichroomkleuring (collageen blauw/groen,
spier rood, kern zwart) en zilverimpregnatie (reticulaire vezels zwart, argyrofiel) zijn ontdekt door
trial-and-error. Histochemische kleuringen berusten op een specifieke chemische reactie: de PAS-
kleuring (Periodic Acid-Schiff) oxideert glycolgroepen in polysacchariden en mucines tot aldehyden
die met Schiff-reagens magenta kleuren; dit visualiseert glycogeen, mucus en basaalmembranen.
, Enzymhistochemische kleuringen benutten de eigen enzymatische activiteit van het weefsel: het
enzym zet een substraat om tot een zichtbaar gekleurde neerslag ter plaatse van activiteit, waarvoor
vriescoupes vereist zijn (enzymen zijn niet actief na paraffine-inbedding). Immunohistochemische
kleuringen (IHC) gebruiken specifieke antilichamen om eiwitten te detecteren via enzymreactie
(DAB, bruin) of fluorochroom. Een delende cel kan worden geïdentificeerd met IHC tegen Ki-67
(nucleair proliferatiemarker aanwezig in alle actieve fases van de celcyclus, afwezig in G0) of via
zichtbare mitotische figuren (condensed chromosomen, spoelfiguur) op standaard HE.
VRAAG 6: Bespreek 3 toepassingen van immunohistochemie en hoe deze kunnen helpen bij
pathologische diagnostiek.
Uitleg: Immunohistochemie heeft drie belangrijke klinische toepassingen in de pathologische
diagnostiek. Ten eerste de tumorclassificatie en bepaling van tumoroorsprong: bij metastase naar
een onbekende locatie bepalen weefselspecifieke markers de herkomst van de primaire tumor.
Cytokeratines (CK) zijn aanwezig in epitheelcellen en positief bij carcinomen (het patroon
CK7+/CK20- wijst op longcarcinoom, CK7-/CK20+ op colorectaal carcinoom); vimentine is positief
bij sarcomen; LCA (leukocyt common antigen) bij lymfomen; S100/HMB45 bij melanoom. Ten
tweede de bepaling van prognose en behandelrespons via receptorstatus: bij borstkanker bepalen
ER (oestrogeenreceptor), PR (progesteronreceptor) en HER2 de therapiekeuze; ER+/PR+ tumoren
reageren op hormonale therapie (tamoxifen), HER2-overexpressie op trastuzumab. De proliferatie-
index Ki-67 geeft aan welk percentage cellen actief deelt en voorspelt de agressiviteit. Ten derde de
detectie van infectieuze agenten en prognostische markers: virussen zoals HPV, CMV en EBV
kunnen in weefsel worden aangetoond met specifieke antilichamen, wat therapie en prognose
stuurt. IHC is zo onmisbaar in de moderne pathologie voor zowel tumorclassificatie als
therapieselectie.
VRAAG 7: Bespreek het principe van scanning electronenmicroscopie (SEM). Wat kan je met
deze methode bestuderen?
Uitleg: Bij scanning-elektronenmicroscopie (SEM) wordt een fijne primaire elektronenbundel,
afkomstig van een elektronenkanon, systematisch over het oppervlak van het preparaat geleid door
elektromagnetische lensjes en scanning-spoelen. Wanneer de primaire elektronen het oppervlak
raken, komen secundaire elektronen vrij (energie <50 eV) die enkel uit de bovenste nanometers van
het oppervlak ontsnappen; de intensiteit is afhankelijk van de hellingshoek en topografie, wat een
driedimensionaal beeld oplevert. Een detector (Everhart-Thornley detector) registreert deze
secundaire elektronen en een computer assembleert het beeld pixel per pixel. Terugverstrooide
elektronen (BSE, hogere energie) geven aanvullend informatie over de elementaire samenstelling.
Vergrotingen tot 100.000× zijn mogelijk met een resolutie van 1-5 nm. Preparaatvoorbereiding
