Samenvatting moleculaire celbiologie

Moleculaire celbiologie
Hoofdstuk 1: post-transcripti onele gencontrole en nucleair transport
1. Genen in eukaryotische celsystemen

Dierlijke cel: plasmamembraan

Plantencel: celwand om rigiditeit te behouden, turgor door vacuole (gevuld met water, suiker),
chloroplasten, plasmodesmata (juncties)

Extra cellulaire vesikels (EV) = exosomen: lichaampjes die uit de cel treden en naar een andere cel
gaan <-> Exosomen zijn ook moleculen die RNA kunnen afbreken


Recombinante DNA technologie

Complex DNA (dus totale genoom van enkele cel/ organisme/ weefsel) ondergaat specifieke
amplificatie van 1 enkel DNA fragment. Klonering kan op 2 manieren gebeuren:

 Cell based DNA cloning (in vivo): vector + insert wordt getransformeerd in bacterie.
Your favorite gene (YFG) wordt het insert genoemd.
Plasmide vector bestaat uitori, ampr
Met behulp van restricitie-enzymen wordt insert DNA in plasmide vector geplaatst in de
multiple cloning site (MCS = polylinker), ter vormig van een recombinant plasmide.
E.coli mixen met plasmide en cultuur van maken van nutriënt agar dat ampicilline bevat.
Bacteriën die plasmide niet opnemen sterven door de antibiotica. Getransformeerde cellen
(die plasmide wel hebben opgenomen) overleven en gaan het plasmiden repliceren om
kopieën te kunnen doorgeven aan dochtercellen. Je krijgt kolonies.

o Conventionele klonering met restrictie enzymen:
YFG bevat aan beide uiteindes restrictie sites, waarop restrictie enzymen binden. Die
RE kauwen stuk enkelstrengig DNA van dubbelstrengig DNA aan beide uiteindes
waardoor sticky ends ontstaan. Hetzelfde gebeurt bij een bacterieel plasmide, die
hebben ook een restrictieplaats waar RE aan binden en sticky ends ontstaan. Sticky
ends van plasmide en gen ligeren mbv DNA ligase. Getransformeerd plasmide is
gevormd.

o Golden Gate Assembly cloning (adaptors/linkers)
Dit kan met 2 verschillende startproducten:
 Beginnende van een DNA fragment en vector:
Restrictie endonucleases knippen de multiple cloning site uit de vector en
vormen sticky ends. RE kauwen enkelstrengig DNA af van fragment, zoals
hierboven beschreven staat, ook ter vorming van sticky ends. De sticky ends
worden geligeerd met DNA ligase.
 Beginnende van 2 vectoren (1 waar gen uit gehaald wordt, andere waar
casette in geplaats wordt):
Restrictie endonucleases knippen de multiple cloning site uit de vector en
vormen sticky ends. RE knippen YFG uit vector A en maken sticky ends aan
beide uiteindes. De sticky ends worden geligeerd met DNA ligase.

, Getransformeerde plasmiden worden gemengd met bacterie en in cultuur
gebracht.

2 procedures waarop mechanisme werkt:
 2 stap procedure (verschillende temperaturen):
1) Overlap
2) RE voeren chew back uit (gaan DNA afbijten)
3) Herstellen met Taq polymerase en Tag ligase.
 1 stap procedure (alles bij 50 °C, PCR bij isotherme amplificatie):
o Gateway cloning:
att.: plaats van integratie
attP: bij gaaf
attB: attachment site van bacterie
1) BP reactie:
De donor vector draagt het gen ccdB, wanneer dit gen alleen aanwezig is is het
toxisch en gaat de bacterie dood. attB1 site van YFG is complementair met attP1
site van donor vector, idem voor attB1 en attP2. Tijdens BP reactie wordt gen
(casette) in donor vector gestoken, waarbij bijproduct ccdB gevormd wordt. Er
wordt entry vector gevormd met als casette YFG en 2 plaatsen voor integratie
attL1 en attL2, die het toxische gen niet meer bevat.
2) LR reactie:
Entry vector en bestemmingsvector worden gemend. Bestemmingsvector bevat
ccdB gen en 2 attR sites. LR reactie vindt plaats tussen attL sites van entry vector
en attR sites van andere vector, ter vorming van een expressievector
getransformeerd met YFG en attB sites. Bijproduct is toxisch, want is een vector
getransformeerd met ccdB, met attP sites.
 PCR based DNA cloning (in vitro): favoriet gen amplificeren


Expressie vectoren en reporter genen

Bacteriële expressie vector bevat RBS: ribosome binding site: maakt het mogelijk voor ribosoom om
translatie uit te voeren (geen RBS -> geen translatie)

Eukaryotische expressie vector:
Prototype van plasmide: (foto dia 13)


Analyse van genen in eukaryotische celsystemen

Expressie van vreemd gen in dierlijke en planten cellen:

- Transiënte en stabiele expressie
o Transiënte transfectie: (transfectie= inbrengen van DNA fragment in gekweekte cel)
Beginnen bij vector met YFG, transfect gekweekte cellen worden gevormd door lipide
behandeling of elektroporatie. (die cellen gaan dus tijdens die behandelingen die
vector opnemen)
Sommige cellen nemen vector op, dan wordt cDNA overgeschreven naar RNA en RNA
wordt vervolgens vertaald in eiwit dat tot expressie komt in de cel.
Sommige cellen nemen vector niet op, dus eiwit komt dan niet tot expressie.

, Of de cellen vector opnemen of niet is toevallig.
Eigenschappen:
 Tijdelijke expressie (transiënt)
 Geen integratie (YFG wordt niet opgenomen in gastheer genoom)
 Geen selectie
 24-72 uur

o Stabiele transfectie (transformatie):
1) Vector bevat YFG en neo-resistent gen (neor).
2) Transfect gekweekte cellen worden gevormd door lipide behandeling of
elektroporatie.
3) Die cellen uitplaten op medium, waaraan G-418 toegevoegd is; G-418 resistente
klonen gevormd. Als de cellen neo-resistent zijn (dus neo r gen hebben
opgenomen), dan gaan die cellen overleven, de andere niet. G-418 kan dus
overwonnen worden door resistentie als je neor inbouwt.
4) Vector kan integreren in genoom van gastheer, gastheer gaat vervolgens YFG tot
expressie brengen.

Eigenschappen:

 Permanente expressie
 Wel integratie
 Selectie nodig
 MAAR bij stabiele transfectie kan overexpressie van eiwit voorkomen
(doordat op teveel plaatsen YFG is toegevoegd), waardoor eiwit za l
neerslaan (aggregaten vormen, is niet goed vr eiwit). -> afwegen tss voor- en
nadelen van stabiel en transiënt
- Selectiesystemen voor stabiele en transiënte expressie
1) Vector met YFG, promotor en aph gen (=selectiemarker gen dat codeert voor neo-
resistentie cassette, = aminoglycoside phosphotransferase). DNA wordt getranfecteerd in
cellen (vectoren worden toegediend aan cellen).
2) 24-48 u wacgten bij 37°C.
Sommige cellen hebben YFG opgenomen, sommige niet.
3) – selectie voor transfected gen marker, dus selectie door cellen over te brengen in
medium met G418. -> Alleen G418-resistente kolonies kunnen groeien (dat zijn dus de
cellen die neo-resistent zijn en dus construct hebben opgenomen (plasmide DNA wordt
stabiel ingebouwd in chromosomaal DNA)). Door selectie sterven de cellen die
transfected DNA niet geïntegreerd hebben.
– cellen groeien zonder selectie, meeste cellen hebben construct niet opgenomen en
verliezen plasmide DNA.

- Methoden voor gentransfer in dierlijke cellen in cultuur:
o Celcultuur:
Cellen ondergaan 10-60 celdelingen en sterven dan af
Er zijn cellen (zoals tumorcellen) die continu blijven delen, maar tumorale cellen
groeien alleen efficiënt en snel in gepast medium.
Media voor celculturen:
 RPMI medium (RPMI-1630 en RPMI-1640)
 EMEM

,  DMEM
 Opti-MEM
o Selectie:
Op basis van genetische complementatie (= je complementeert door toe te voegen
wat je ontbreekt): selectie voor thymidine kinase met HAT medium (hypoxantine,
aminopterine, thymine).  dus: vector binnenbrengen die TK gen bevat. Als de cel
TK negatief is (dus geen TK gen heeft) en die neemt vector met TK gen op, dan wordt
dat gen ‘hersteld’.
Dominante selectiemerker gebruiken, zoals G418 (neomicine)

- Transfectie
o Door calciumchloride (calciumfosfaat) precipitatie
1) DNA van virus isoleren zodanig dat je naakt DNA krijgt.
2) DNA toevoegen aan CaCl2 in fosfaatbuffer en laten neerslaan (precipitatie)
3) DNA toevoegen aan actief delende cellen (condities kennen?)
4) Medium verversen, 7 dagen wachten bij 37°C.
5) DNA oplossing verwijderen.
6) Medium overbrengen. Als cel DNA van virus heeft opgenomen, dan komt dat
DNA tot expressie in cel en kan er leefbaar viruspartikel gevormd worden.
o Liposoom gemedieerde gentransfert (lipofectie):
Bv. lipofectine, lipofectamine
1) DNA (neg geladen) inpakken in vetpartikels, lipiden vormen dubbellaag rond DNA
moleculen.
2) Liposomen toevoegen aan medium met cellen. Pos geladen liposomen
interageren met neg geladen celloppervlaktes van zoogdieren.
3) Liposoom dubbellaag fuseert met plasmamembraan, cel neemt lipide-DNA
complex op en transfected DNA kan zo nucleus binnenkomen.

o Door elektroporatie:
1) Cellen worden gemend met DNA (met vector met daarin YFG en selectie merker
gen) in speciale cuvet met elektrodes.
2) Elektroshoque toedienen, waardoor poriën in celmembraan ontstaan. Cel neemt
via poriën DNA op en DNA kan zo nucleus binnendringen. Er is geen herschikking
of modificatie van opgenomen DNA en DNA ondervindt geen hinder van
endocytotische vesikels. Heel veel werk in cel steken om die te herstellen (want
gaten in celmembraan)
3) Cellen worden op nieuw medium gezet. Afhankelijk of selectie wel of niet wordt
toegevoegd, wordt er stabiele of transiënte expressie verkregen.

o Via receptor gemedieerde endocytose:
1) Neg geladenn DNA bindt aan pos geladen polylysine (dat geconjugeerd is aan
transferrine).
2) DNA vormt toroïde met transferrine moleculen aan buitenkant gelegen, om te
kunnen binden aan transferrine receptoren.
3) Die specifieke binding tussen transferrine en zijn receptoren op het celoppervlak
gebeurd.