Moleculaire diagnostiek 1
H1, 2 en 3
● Mendel: concept van overerving (genen en allelen) met kweekproeven van erwten
● Morgan: Ontdekking dat genen op chromosomen liggen door experiment met
fruitvliegjes
● Watson & Crick: presenteerden dubbele DNA helix (1953)
● DNA: fosfaatgroep, stikstofbase en suiker (deze drie elementen samen vormen een
nucleotide)
○ Nucleïnezuren (A, T, G en C) gebonden aan een deoxyribose
○ Fosfaat aan de 5’ koolstofatoom van het suikermolecuul
○ Stikstof aan de 1’ koolstofatoom van het suikermolecuul
○ Verschil ribose: bevat aan 2’ koolstofatoom een OH groep en deoxyribose
alleen een H
○ Pyrimidines: enkele ring (Cytosine, Uracil en Thymine)
○ Purines: dubbele ring (Guanine en adenine)
○ Backbone: uit hydroxylgroepen gebonden aan fosfaatgroepen
○ Nucleoside: Stikstofbase gebonden aan een niet- gefosforyleerde suiker
■ Adenosine, Guanosine, Cytidine en Thymidine
● Radioactieve nucleotiden
○ Fosfaatgroepen worden aangeduid met alfa, bèta of gamma
● DNA replicatie
○ Fosfodiesterbinding wordt gevormd tussen de 3’- hydroxylgroep van de
groeiende streng en de 5’- fosfaatgroep van een nieuwe nucleotide
○ Altijd een primer nodig voor DNA polymerase
○ Nucleotiden worden gekoppeld aan het 3’ einde van de streng (groeiende
streng)
■ DNA polymerase leest de template van 3’-5’, dus nieuwe streng wordt
5’-3’
■ Lagging strand: d.m.v. okazaki fragmenten
● Nucleïnezuren zijn macromoleculen bestaande uit nucleotiden
○ Twee uiteinden: 5’- fosfaatgroep en 3’- hydroxylgroep
○ Hybridisatie= vorming van waterstofbruggen tussen twee complementaire
strengen van DNA
■ Tussen A-T 2 H-bruggen
■ Tussen C-G 3 H-bruggen
○ ssDNA= single stranded DNA
○ dsDNA= double stranded DNA
● dsDNA windt zich om histonen en vormt een netwerk van nucleosomen
○ Chromatine= complex van DNA en eiwitten in de nucleus
● DNA synthese moleculen
○ Polymerase: katalyseert de vorming van een fosfodiesterbinding
○ Primase: Synthetiseert een kort RNA fragment
○ Methylase: Voegt methylgroepen toe aan stikstofbasen
1
, ○ Deaminiases: neemt aminogroepen uit stikstofbasen
○ Nucleases: knipt in het DNA
○ Ligases: katalyseert de vorming van een enkele fosfodiesterbinding
○ Helicases: verbreekt H- bruggen tussen stikstofbasen
○ Topiomerases: zorgt ervoor dat het DNA gaat uncoilen
● DNA polymerase I
○ 5’-3’ exonuclease activiteit → afbraak oude streng
○ 5’-3’ polymerase activiteit → synthese van nieuwe streng
○ 3’-5’ exonuclease activiteit → proofreading (dmv hydrolyse knipt hij
verkeerde eruit)
● Klenow fragment: bevat de 5’-3’ polymerase activiteit en 3’-5’ exonuclease activiteit
● Nick translation
○ Aantonen van gelabelde nucleotiden in het DNA
○ Er wordt een Nick gemaakt in het DNA (breuk in enkelstrengs stuk
DNA) → polymerase voegt nucleotiden toe aan het 5’ uiteinde van
een nick richting het 3’ uiteinde van een streng → door ligase wordt
Nick afgesloten
● Restrictie- enzymen
○ Exonucleases: verwijderen basen van 3’- hydroxylgroep of 5’- fosfaatgroep
van DNA strengen (knippen aan het einde)
○ Endonucleases: breekt de suiker- fosfaastbinding af, interne snijding van
DNA (knippen middenin DNA)
● Soorten knipjes
○ Sticky end en blunt end
○ Sticky ends kunnen beter worden gerecombineerd
2
, ● Radio- actieve nucleotiden
○ Fosfaatgroepen aangeduid met griekse letters
● Het centrale dogma
○ DNA → RNA → eiwitten
● Cap van RNA dient als bescherming en herkenningssignaal voor probes van
translatie
● Intronen = niet coderend, exonen= coderend
● Aan de 3’- CCA uiteinde van het tRNA bindt een aminozuur
● Translatie
○ Cisfactoren: omvatten een bepaald gebied van DNA of RNA die genexpressie
reguleert (Silencers= remmen, enhancers= bevorderen)
○ Transfactoren: binden aan cis sequenties en stellen direct de transcriptie
complexen samen op het juiste gen
● RNAi (RNA interferentie) gen expressie regulatie:
○ MiRNA = microRNA
■ Expressie van genen reguleren, door te koppelen aan stukken
complementaire sequenties in mRNA’s en zo de translatie te remmen
■ Lengte: 20-25 nucleotiden
■ Door RNase vervormd tot hairpin
○ SiRNA = small interfering RNA
■ Functionele tussenproducten van RNA interferentie, verdediging tegen
virale invasie in eukaryoten
3
H1, 2 en 3
● Mendel: concept van overerving (genen en allelen) met kweekproeven van erwten
● Morgan: Ontdekking dat genen op chromosomen liggen door experiment met
fruitvliegjes
● Watson & Crick: presenteerden dubbele DNA helix (1953)
● DNA: fosfaatgroep, stikstofbase en suiker (deze drie elementen samen vormen een
nucleotide)
○ Nucleïnezuren (A, T, G en C) gebonden aan een deoxyribose
○ Fosfaat aan de 5’ koolstofatoom van het suikermolecuul
○ Stikstof aan de 1’ koolstofatoom van het suikermolecuul
○ Verschil ribose: bevat aan 2’ koolstofatoom een OH groep en deoxyribose
alleen een H
○ Pyrimidines: enkele ring (Cytosine, Uracil en Thymine)
○ Purines: dubbele ring (Guanine en adenine)
○ Backbone: uit hydroxylgroepen gebonden aan fosfaatgroepen
○ Nucleoside: Stikstofbase gebonden aan een niet- gefosforyleerde suiker
■ Adenosine, Guanosine, Cytidine en Thymidine
● Radioactieve nucleotiden
○ Fosfaatgroepen worden aangeduid met alfa, bèta of gamma
● DNA replicatie
○ Fosfodiesterbinding wordt gevormd tussen de 3’- hydroxylgroep van de
groeiende streng en de 5’- fosfaatgroep van een nieuwe nucleotide
○ Altijd een primer nodig voor DNA polymerase
○ Nucleotiden worden gekoppeld aan het 3’ einde van de streng (groeiende
streng)
■ DNA polymerase leest de template van 3’-5’, dus nieuwe streng wordt
5’-3’
■ Lagging strand: d.m.v. okazaki fragmenten
● Nucleïnezuren zijn macromoleculen bestaande uit nucleotiden
○ Twee uiteinden: 5’- fosfaatgroep en 3’- hydroxylgroep
○ Hybridisatie= vorming van waterstofbruggen tussen twee complementaire
strengen van DNA
■ Tussen A-T 2 H-bruggen
■ Tussen C-G 3 H-bruggen
○ ssDNA= single stranded DNA
○ dsDNA= double stranded DNA
● dsDNA windt zich om histonen en vormt een netwerk van nucleosomen
○ Chromatine= complex van DNA en eiwitten in de nucleus
● DNA synthese moleculen
○ Polymerase: katalyseert de vorming van een fosfodiesterbinding
○ Primase: Synthetiseert een kort RNA fragment
○ Methylase: Voegt methylgroepen toe aan stikstofbasen
1
, ○ Deaminiases: neemt aminogroepen uit stikstofbasen
○ Nucleases: knipt in het DNA
○ Ligases: katalyseert de vorming van een enkele fosfodiesterbinding
○ Helicases: verbreekt H- bruggen tussen stikstofbasen
○ Topiomerases: zorgt ervoor dat het DNA gaat uncoilen
● DNA polymerase I
○ 5’-3’ exonuclease activiteit → afbraak oude streng
○ 5’-3’ polymerase activiteit → synthese van nieuwe streng
○ 3’-5’ exonuclease activiteit → proofreading (dmv hydrolyse knipt hij
verkeerde eruit)
● Klenow fragment: bevat de 5’-3’ polymerase activiteit en 3’-5’ exonuclease activiteit
● Nick translation
○ Aantonen van gelabelde nucleotiden in het DNA
○ Er wordt een Nick gemaakt in het DNA (breuk in enkelstrengs stuk
DNA) → polymerase voegt nucleotiden toe aan het 5’ uiteinde van
een nick richting het 3’ uiteinde van een streng → door ligase wordt
Nick afgesloten
● Restrictie- enzymen
○ Exonucleases: verwijderen basen van 3’- hydroxylgroep of 5’- fosfaatgroep
van DNA strengen (knippen aan het einde)
○ Endonucleases: breekt de suiker- fosfaastbinding af, interne snijding van
DNA (knippen middenin DNA)
● Soorten knipjes
○ Sticky end en blunt end
○ Sticky ends kunnen beter worden gerecombineerd
2
, ● Radio- actieve nucleotiden
○ Fosfaatgroepen aangeduid met griekse letters
● Het centrale dogma
○ DNA → RNA → eiwitten
● Cap van RNA dient als bescherming en herkenningssignaal voor probes van
translatie
● Intronen = niet coderend, exonen= coderend
● Aan de 3’- CCA uiteinde van het tRNA bindt een aminozuur
● Translatie
○ Cisfactoren: omvatten een bepaald gebied van DNA of RNA die genexpressie
reguleert (Silencers= remmen, enhancers= bevorderen)
○ Transfactoren: binden aan cis sequenties en stellen direct de transcriptie
complexen samen op het juiste gen
● RNAi (RNA interferentie) gen expressie regulatie:
○ MiRNA = microRNA
■ Expressie van genen reguleren, door te koppelen aan stukken
complementaire sequenties in mRNA’s en zo de translatie te remmen
■ Lengte: 20-25 nucleotiden
■ Door RNase vervormd tot hairpin
○ SiRNA = small interfering RNA
■ Functionele tussenproducten van RNA interferentie, verdediging tegen
virale invasie in eukaryoten
3
