Microscopy & image analyse HC D1
Inhoudsopgave
HC1 Light and color (H2) (6) .............................................................................................................................. 2
HC2 Basic optics (H1, H4, H5, H6) (10) .............................................................................................................. 8
HC3 Contrast techniques (H7) (13) ................................................................................................................. 18
HC4 Fluorescence microscopy (H11) (12) ........................................................................................................ 31
HC5 Sample prep, fluorophores, dyes (H11, H16) (13) .................................................................................... 43
HC6 Confocal microscopy (H13) (8) ................................................................................................................ 56
HC7 Super resolution microscopie (H15) (10) ................................................................................................. 64
HC8 Live cell imaging 2 (H16) (9) .................................................................................................................... 74
HC9 Imaging dynamic molecular processes basic (H12)(9).............................................................................. 83
HC10 visualising cells, Electron Microscopy (EM) (9) ...................................................................................... 92
HC11 Image analyses and correlative light en EM (12) ................................................................................. 101
HC12 applications of EM (12) ....................................................................................................................... 113
1
,HC1 Light and color (H2) (6)
Geschiedenis van microscopy
• de eerste compound microscoop (2 lensen): Janssen, 3-10x
• compound microscoop (multiple lens): Hooke, 50x
• Simple microscoop (single lens): van Leeuwenhoek, 275x
Constrast genereren: gespecialiseerde staining procedueres
• Bij hoge vergroting (magnification) hebben de meeste cellen en weefsels weinig
structuur (transparant)
• Histologische kleuring: Hematoxyline (kernen) en eosine (proteïnen) kleuring (H&E) –
de gouden standaard in medische diagnose
Licht microscopue evolutie (hoef je nie te kennen)
Generating contrast: speciale optics
• Dit is door doorvallend (transmitted) licht zonder dat de cellen gekleurd zijn.
• Door licht op een andere manier op de samples te schijnen, dus door
gepolariseert licht, kan je structuren gaan zien die je bij normaal licht niet ziet
Electronen microscopie
• 1931: Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)
• 1942: Scannende elektronenmicroscoop (SEM)
Fluorescence microscopy
• 1920 Introductie van fluorescerende kleurstoffen om biologisch materiaal te kleuren
• 1941 (Cooms et al) Proteïneconjugatie aan fluorochromen -> immunofluorescentie
• 1957 Ontwikkeling van de confocale microscoop door Marvin Minksy, maar de
algemene acceptatie ervan zal tot eind jaren 80 duren
o Door confocale microscopie kan je naar 1 vlak kijken, dan heb je geen last van
alles wat er boven en onder zit. Als je dat niet gebruikt krijg een grote blurr
• 1992 klonen van GFP (Douglas Prasher) en 1994 expressie in C. elegans (Martin
Chalfie)
o GFP: Green Fluorescent Protein
Compound microscope
• Compound microscopie bevat 2 lampen, 1 normale voor transmitted licht
microscopie en 1 LED (of mercury Arc) lamp voor epi-fluorescentie of epi-illuminatie
• Widefield: het hele monster wordt belicht met licht (bijv. brightfield, fasecontrast en
widefield-fluorescentie)
• Transmitted licht microscopie: Licht gaat door het monster. Licht wordt gefocust
door de condensor en verzameld door het objectief (bijv. brightfield, fasecontrast)
• Epi-fluorescentiemicroscopie of epi-illuminatie: de lichtbron en het beeld gaan door
dezelfde objectieven (vaak gebruikt voor fluorescentiemicroscopie)
o Deze schijnt licht op digronische spiegel dat zorgt dat het licht wordt gefiltert
zodat je nog maar 1 kleur licht hebt, het weerkaats maar 1 kleur licht en
absorbeert de rest. Het weerkaaste groene licht in dit geval, gaat naar de
2
, sample en die neemt het licht op en veranderd de kleur van het licht en
beetje en rood licht komt terug en rood wordt niet meer weerkaats door die
spiegel en wordt doorgelaten.
o Voordeel hiervan is dat je met 1 objectief zowel je sample kan belichten als je
licht kan collecteren, waardoor je heel dicht met je objectief bij je sample kan
zitten. Aangezien je anders licht van ene kant en objectief aan andere kant
zou moeten hebben en dan zit je te kloten dat er geen ruimte is om bij elkaar
te komen.
o Hierbij belicht je je hele sample met 1 kleur
• Confocaal: confocale laserscanmicroscoop (heeft meestal ook een
groothoekmogelijkheid tot het interessegebied)
o Hierbij werk je met een laser ipv een lamp en ipv je hele sample te
belichten met een bepaalde kleur, ga je met een laser scanen. Je gaat dan
plekje voor plekje met je laser scannen.
o Voordeel hiervan is dat je het heel gefocust het licht op 1 plek kan doen,
waardoor je ook in de diepte een scherper beeld krijgt en dus minder last
hebt van alle fluorescentie wat boven en onder je sample zit.
Licht microscope: configuraties
• Upright microscope: meest gebruikt voor gefixeerde cellen
• Inverted microscope: hierbij zit alles omgedraagd dus de lamp zit onder
en scheint via een spiegel een kleur licht omhoog door je sample. Als je
cellen nog levens zijn (dus niet gefixeert) dan heb je ze in een bakje met vloeistof om
ze levens te houden en dan wil je ze niet omdraaien dus dan kijk je vanuit onder met
je objectief er naar toe.
What is de grootte van een:
• Cell: 10-20micro meter, Kern: 50 micrometer?, Mitochondrien: 2micro meter (groter
in lengte), Eiwit: 20nm, atoom: 0.2nm
De resolutie van microscopen
• Resolutie: De kleinste afstand waarop twee objecten nog als afzonderlijke objecten
kunnen worden opgelost.
• Let op: hogere resolutie betekent kleinere afstand (Formeel zou de resolutie
1/d moeten zijn)
o Mensen oog: 1km-100um (humaan ei)
o Licht microscopie: 1cm-100nm (virus particle)
o Elektronen microscopie: 100um-0.1nm (atoom)
• Waarom lichtmicroscopie
o Live-cell imaging
o Selectief labeling
• Waarom elektronenmicroscopie?
o Beste resolutie
o Context
3
, Wat is licht?
• 1) Een vorm van energie die elektromagnetische straling wordt genoemd
• 2) Kleur komt overeen met golflengte
• 3) Eigenschappen van deeltjes en golven
o Golfeigenschap: interferentie-> golven kunnen elkaar versterken of dimmen
o Deeltjeseigenschap: discrete eenheden van energie
2) Kleur komt overeen met golflengte
• Maar heel klein deel is zichtbaar voor ons oog, veel dieren kunnen veel
meer golflengtes zien. Hoe kleiner de golflengte hoe schadelijker
• 400nm-700nm is zichtbaar voor ons (spectrum van wit licht): 400nm is
paars/blauw en 700nm is rood
• De groote van zichtbaar licht zit net onder orde van grootte van bacterien. De
resolutie die je haalt is ongeveer de helft van je golflengte. dus als je golflengte van
400nm gebruikt dan kan je dingen onderscheiden van 200nm. Als we kleinere dingen
willen onderscheiden moeten we andere elektromagnetische straling gebruiken dan
gewoon normaal licht.
3) Licht als een golf: interferentie
• Inteferentie: Als twee golflengtes in fase lopen kunnen ze elkaar vesterken
(bright) en als ze uit fase lopen kunnen ze elkaar uitdoven (dimmen)
Eigenschap van licht
• Soms beschouwen we licht meer als deeltje en dat is als meer als we het hebben
over fliuorescentie. Dus een GFP eiwit heeft 1 foton van een bepaalde golflengte
nodig om aangeslagen te worden.
• Licht als: (a) Quanta (b) Golven (c) Vectoren (d) Stralen (golven)
De kwaliteit van het licht beschrijven
• Monochromatisch vs polychromatisch
o Monochromatisch: Golven hebben dezelfde frequentie
• Lineair polariseerd vs nonpolarized
o Lineair polariserend: Golven trillen parallel
• Coherent vs non coherent:
o Coherent: Golven/fotonen zijn in fase (in laser)
o Non coherend: golven/fotonen hebben een willekeurige fase (in led, en
meeste lichtbronnen)
• Collimated vs divergent
o Collimated: Golven planten zich voort in dezelfde richtingen
o Divergent: Golven divergeren van elkaar
• Lasers zijn monochromatisch, gepolariseerd en coherent
Polarisatie van licht
• Licht van de zon is niet gepolariseert (gaat alle kanten op) maar als het weerkaast
wordt door wegdek of water dan is het wel gepolariseert (gaat nog maar 1 kant op).
4
Inhoudsopgave
HC1 Light and color (H2) (6) .............................................................................................................................. 2
HC2 Basic optics (H1, H4, H5, H6) (10) .............................................................................................................. 8
HC3 Contrast techniques (H7) (13) ................................................................................................................. 18
HC4 Fluorescence microscopy (H11) (12) ........................................................................................................ 31
HC5 Sample prep, fluorophores, dyes (H11, H16) (13) .................................................................................... 43
HC6 Confocal microscopy (H13) (8) ................................................................................................................ 56
HC7 Super resolution microscopie (H15) (10) ................................................................................................. 64
HC8 Live cell imaging 2 (H16) (9) .................................................................................................................... 74
HC9 Imaging dynamic molecular processes basic (H12)(9).............................................................................. 83
HC10 visualising cells, Electron Microscopy (EM) (9) ...................................................................................... 92
HC11 Image analyses and correlative light en EM (12) ................................................................................. 101
HC12 applications of EM (12) ....................................................................................................................... 113
1
,HC1 Light and color (H2) (6)
Geschiedenis van microscopy
• de eerste compound microscoop (2 lensen): Janssen, 3-10x
• compound microscoop (multiple lens): Hooke, 50x
• Simple microscoop (single lens): van Leeuwenhoek, 275x
Constrast genereren: gespecialiseerde staining procedueres
• Bij hoge vergroting (magnification) hebben de meeste cellen en weefsels weinig
structuur (transparant)
• Histologische kleuring: Hematoxyline (kernen) en eosine (proteïnen) kleuring (H&E) –
de gouden standaard in medische diagnose
Licht microscopue evolutie (hoef je nie te kennen)
Generating contrast: speciale optics
• Dit is door doorvallend (transmitted) licht zonder dat de cellen gekleurd zijn.
• Door licht op een andere manier op de samples te schijnen, dus door
gepolariseert licht, kan je structuren gaan zien die je bij normaal licht niet ziet
Electronen microscopie
• 1931: Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)
• 1942: Scannende elektronenmicroscoop (SEM)
Fluorescence microscopy
• 1920 Introductie van fluorescerende kleurstoffen om biologisch materiaal te kleuren
• 1941 (Cooms et al) Proteïneconjugatie aan fluorochromen -> immunofluorescentie
• 1957 Ontwikkeling van de confocale microscoop door Marvin Minksy, maar de
algemene acceptatie ervan zal tot eind jaren 80 duren
o Door confocale microscopie kan je naar 1 vlak kijken, dan heb je geen last van
alles wat er boven en onder zit. Als je dat niet gebruikt krijg een grote blurr
• 1992 klonen van GFP (Douglas Prasher) en 1994 expressie in C. elegans (Martin
Chalfie)
o GFP: Green Fluorescent Protein
Compound microscope
• Compound microscopie bevat 2 lampen, 1 normale voor transmitted licht
microscopie en 1 LED (of mercury Arc) lamp voor epi-fluorescentie of epi-illuminatie
• Widefield: het hele monster wordt belicht met licht (bijv. brightfield, fasecontrast en
widefield-fluorescentie)
• Transmitted licht microscopie: Licht gaat door het monster. Licht wordt gefocust
door de condensor en verzameld door het objectief (bijv. brightfield, fasecontrast)
• Epi-fluorescentiemicroscopie of epi-illuminatie: de lichtbron en het beeld gaan door
dezelfde objectieven (vaak gebruikt voor fluorescentiemicroscopie)
o Deze schijnt licht op digronische spiegel dat zorgt dat het licht wordt gefiltert
zodat je nog maar 1 kleur licht hebt, het weerkaats maar 1 kleur licht en
absorbeert de rest. Het weerkaaste groene licht in dit geval, gaat naar de
2
, sample en die neemt het licht op en veranderd de kleur van het licht en
beetje en rood licht komt terug en rood wordt niet meer weerkaats door die
spiegel en wordt doorgelaten.
o Voordeel hiervan is dat je met 1 objectief zowel je sample kan belichten als je
licht kan collecteren, waardoor je heel dicht met je objectief bij je sample kan
zitten. Aangezien je anders licht van ene kant en objectief aan andere kant
zou moeten hebben en dan zit je te kloten dat er geen ruimte is om bij elkaar
te komen.
o Hierbij belicht je je hele sample met 1 kleur
• Confocaal: confocale laserscanmicroscoop (heeft meestal ook een
groothoekmogelijkheid tot het interessegebied)
o Hierbij werk je met een laser ipv een lamp en ipv je hele sample te
belichten met een bepaalde kleur, ga je met een laser scanen. Je gaat dan
plekje voor plekje met je laser scannen.
o Voordeel hiervan is dat je het heel gefocust het licht op 1 plek kan doen,
waardoor je ook in de diepte een scherper beeld krijgt en dus minder last
hebt van alle fluorescentie wat boven en onder je sample zit.
Licht microscope: configuraties
• Upright microscope: meest gebruikt voor gefixeerde cellen
• Inverted microscope: hierbij zit alles omgedraagd dus de lamp zit onder
en scheint via een spiegel een kleur licht omhoog door je sample. Als je
cellen nog levens zijn (dus niet gefixeert) dan heb je ze in een bakje met vloeistof om
ze levens te houden en dan wil je ze niet omdraaien dus dan kijk je vanuit onder met
je objectief er naar toe.
What is de grootte van een:
• Cell: 10-20micro meter, Kern: 50 micrometer?, Mitochondrien: 2micro meter (groter
in lengte), Eiwit: 20nm, atoom: 0.2nm
De resolutie van microscopen
• Resolutie: De kleinste afstand waarop twee objecten nog als afzonderlijke objecten
kunnen worden opgelost.
• Let op: hogere resolutie betekent kleinere afstand (Formeel zou de resolutie
1/d moeten zijn)
o Mensen oog: 1km-100um (humaan ei)
o Licht microscopie: 1cm-100nm (virus particle)
o Elektronen microscopie: 100um-0.1nm (atoom)
• Waarom lichtmicroscopie
o Live-cell imaging
o Selectief labeling
• Waarom elektronenmicroscopie?
o Beste resolutie
o Context
3
, Wat is licht?
• 1) Een vorm van energie die elektromagnetische straling wordt genoemd
• 2) Kleur komt overeen met golflengte
• 3) Eigenschappen van deeltjes en golven
o Golfeigenschap: interferentie-> golven kunnen elkaar versterken of dimmen
o Deeltjeseigenschap: discrete eenheden van energie
2) Kleur komt overeen met golflengte
• Maar heel klein deel is zichtbaar voor ons oog, veel dieren kunnen veel
meer golflengtes zien. Hoe kleiner de golflengte hoe schadelijker
• 400nm-700nm is zichtbaar voor ons (spectrum van wit licht): 400nm is
paars/blauw en 700nm is rood
• De groote van zichtbaar licht zit net onder orde van grootte van bacterien. De
resolutie die je haalt is ongeveer de helft van je golflengte. dus als je golflengte van
400nm gebruikt dan kan je dingen onderscheiden van 200nm. Als we kleinere dingen
willen onderscheiden moeten we andere elektromagnetische straling gebruiken dan
gewoon normaal licht.
3) Licht als een golf: interferentie
• Inteferentie: Als twee golflengtes in fase lopen kunnen ze elkaar vesterken
(bright) en als ze uit fase lopen kunnen ze elkaar uitdoven (dimmen)
Eigenschap van licht
• Soms beschouwen we licht meer als deeltje en dat is als meer als we het hebben
over fliuorescentie. Dus een GFP eiwit heeft 1 foton van een bepaalde golflengte
nodig om aangeslagen te worden.
• Licht als: (a) Quanta (b) Golven (c) Vectoren (d) Stralen (golven)
De kwaliteit van het licht beschrijven
• Monochromatisch vs polychromatisch
o Monochromatisch: Golven hebben dezelfde frequentie
• Lineair polariseerd vs nonpolarized
o Lineair polariserend: Golven trillen parallel
• Coherent vs non coherent:
o Coherent: Golven/fotonen zijn in fase (in laser)
o Non coherend: golven/fotonen hebben een willekeurige fase (in led, en
meeste lichtbronnen)
• Collimated vs divergent
o Collimated: Golven planten zich voort in dezelfde richtingen
o Divergent: Golven divergeren van elkaar
• Lasers zijn monochromatisch, gepolariseerd en coherent
Polarisatie van licht
• Licht van de zon is niet gepolariseert (gaat alle kanten op) maar als het weerkaast
wordt door wegdek of water dan is het wel gepolariseert (gaat nog maar 1 kant op).
4
