1. Wat zijn de 3 (of 4) belangrijkste bevindingen van de artikel?
Blz 5
Together, our data suggest that the ASD-linked InsG3680 mutation results in an almost complete loss
of SHANK3 protein, which is consistent with the full deletion of the SHANK3 gene identified in most
Phelan-McDermid Syndrome patients (Bonaglia et al., 2011; Wilson et al., 2003). In contrast, the
schizophrenia-linked R1117X mutation results in the generation of truncated SHANK3 protein, which
could potentially either be partially functional or act in a dominant-negative form.
Blz 8
Together, these results suggest both mutation-specific and circuit-specific upregulation of other
Shank family members, and the upregulation of SHANK1 and SHANK2 mRNAs and proteins in the
cortex of InsG3680+/+ mutant mice may partially compensate for the loss of SHANK3 protein and
thus alleviate synaptic defects in mPFC of InsG3680+/+ mutant mice.
2. Wat is nieuw/voor het eerst gevonden?
Dat ze de cellulaire mechanismen nu ook in kaart hebben gebracht.
3. Alle figuren kunnen beschrijven/ uitleggen
Figuur 1:
a. De verschillende mutaties die ze uitgevoerd hebben.
b. Bij InsG3680 zorgt een frameshift voor een stopcodon en bij R1117X hebben ze een
arginine codon vervangen voor een stopcodon.
Voor c en d hebben ze met een antilichaam tegen de N- en C-terminus gekeken of je verkorte
eiwitten zag in de hersenen. Zoals verwacht zie je met C-terminus antilichaam geen
verwachte bandjes van 135 (InsG) of 122 kDa (R117X) mutatie:
c. Er waren geen duidelijke banden te zien voor InsG3680 mutant muis.
d. In PSD bereiding van striatum cellen van R1117X mutant muizen komt de dikste band
overeen met de verwachte 122 kDa
Vervolgens hebben ze RNAseq uitgevoerd om te kijken of de non-sense mutatie het
expressieniveau heeft aangepast.
e. t/m h, je ziet dat InsG3680+/+ muizen bijna geen SHANK3 mRNA tot expressie brengen
voor alle probes die gebruikt zijn. De R1117X+/+ muizen tonen veel hogere mRNA
levels dan de InsG3680+/+ muizen en het mRNA van deze muizen is dus stabieler.
Aantekeningen bespreking
Doel: mutatie laten zien die ze hebben aangebracht en of het gewerkt heeft
A. Laat zien wat ze wilden doen
B. Hier zie je wat ze dan precies doen in het DNA
C. Je ziet bij de KO dat ze het eiwit indd niet hebben. Bij de homozygoot mutant zie je geen
Shank3 mutant.
D. Hier zie je dat de mutant wel aanwezig is bij de N-terminus aankleuring en het is dus een
verkort eiwit wat wel tot expressie komt.
E. Voor verschillende exonen gekeken om zeker te weten dat ze naar het gehele eiwit
keken ofzo.
De mRNA van G insertie is lager en daarnaast hebben ze voor de western blot alleen gekeken
naar de fractie van PSD eiwitten. Het korte InsG eiwit mist de C-staart die van belang is om
Shank3 in de PSD te houden. De volledige afwezigheid van het eiwit komt dus niet alleen
door de lagere expressie (mRNA level), maar ook door het ontbreken van de C-staart. R1117X
is nog korter, maar zie je wel een heel klein beetje in de western blot, interessant.
Als mRNA te kort of te lang is, wordt het sneller afgebroken en dat is terug te zien in de
mRNA levels.
, Figuur 2:
a. InsG3680+/+ muizen hebben een minder populatie spike respons vergeleken met hun
controle muizen (in het striatum).
b. Zie a
c. Presynaptisch zie je geen effect.
d. R1117X+/+ muizen hebben een vergelijkbare populatie spike respons als hun controle
muizen (in het striatum).*
e. Zie d
f. Presynaptisch zie je geen effect.
g. t/m J, de frequentie aan mini’s (mEPSC) is voor beide mutanten vergelijkbaar met
hun controle
h. –
i. & G tonen wel een amplitude verschil in mEPSCs van InsG3680+/+ muizen en controle
j. –
k. InsG3680+/+ muizen zijn minder interactief dan hun controle muizen.
l. Hier zie je welke gedragingen met name gereduceerd zijn.
m. Dezelfde resultaten zijn gevonden in de R1117X+/+ muizen, maar dan niet significant
n. Zie m
Aantekeningen bespreking
Doel: ze willen naar jonge muizen kijken, want ASD komt vaak al vroeg en dan in de striatum.
A. Corticale neuronen gestimuleerd en gekeken naar de reactie in het striatum. Spike is een
summatie van meerdere neuronen, want extracellulaire meting. Bij de G insertie zie je
dat de amplitude is afgenomen.
B. Je ziet hier dat de amplitude indd lager is.
C. Hier is gekeken naar de presynaptische reactie en deze is hetzelfde voor WT en mutant.
D. –
E. –
F. –
G. Ze kijken nog steeds naar het striatum maar dan naar mEPSCs.
H. –
I. Je ziet dat de InsG mutatie een vergrote mEPSC amplitude heeft. Bij een mEPSC wordt
altijd 1 vesicle afgegeven waar altijd evenveel glutamaat in zit en als de reactie groter is,
heeft de postsynaps dus wss meer receptoren of blijven deze langer open staan. Als
compensatie mechanisme maken de autisme muizen wss meer receptoren (doordat de
stimulatie amplitude dus lager is ofzo). Amplitude is puur een maat voor de hoeveelheid
receptoren en dus voor de respons, maar om een quantum af te geven heb je een
bepaalde kans en dat heeft te maken met de efficiënte van het presynaptische
compartiment. Dit heeft echter ook te maken met de hoeveelheid synapsen. Als 1
neuron heel veel input krijgt, is de frequentie hoger. Frequentie is dus niet alleen een
maat voor de presynaps efficiëntie, maar ook voor de hoeveelheid synapsen. Amplitude
is dus een maat voor postsynaptische dingen en frequentie voor presynaptisch.
J. –
K. Je ziet minder sociale events bij de ASD mutatie.
L. Hier onderverdeeld
M. Bij de schizofrenie mutant zie je dat deze trends ook wel aanwezig zijn, maar niet
significant.
N. Same als M
A t/m F was met stimulatie en dan werd naar meerdere neuronen gekeken vgm en bij
mEPSCs is alleen naar de spontane stromen gekeken. Verder kan je in de supplement zien dat
GluR1 (AMPA subunit) meer in de InsG muizen voorkomt. De InsG mutatie levert dus autisme
Blz 5
Together, our data suggest that the ASD-linked InsG3680 mutation results in an almost complete loss
of SHANK3 protein, which is consistent with the full deletion of the SHANK3 gene identified in most
Phelan-McDermid Syndrome patients (Bonaglia et al., 2011; Wilson et al., 2003). In contrast, the
schizophrenia-linked R1117X mutation results in the generation of truncated SHANK3 protein, which
could potentially either be partially functional or act in a dominant-negative form.
Blz 8
Together, these results suggest both mutation-specific and circuit-specific upregulation of other
Shank family members, and the upregulation of SHANK1 and SHANK2 mRNAs and proteins in the
cortex of InsG3680+/+ mutant mice may partially compensate for the loss of SHANK3 protein and
thus alleviate synaptic defects in mPFC of InsG3680+/+ mutant mice.
2. Wat is nieuw/voor het eerst gevonden?
Dat ze de cellulaire mechanismen nu ook in kaart hebben gebracht.
3. Alle figuren kunnen beschrijven/ uitleggen
Figuur 1:
a. De verschillende mutaties die ze uitgevoerd hebben.
b. Bij InsG3680 zorgt een frameshift voor een stopcodon en bij R1117X hebben ze een
arginine codon vervangen voor een stopcodon.
Voor c en d hebben ze met een antilichaam tegen de N- en C-terminus gekeken of je verkorte
eiwitten zag in de hersenen. Zoals verwacht zie je met C-terminus antilichaam geen
verwachte bandjes van 135 (InsG) of 122 kDa (R117X) mutatie:
c. Er waren geen duidelijke banden te zien voor InsG3680 mutant muis.
d. In PSD bereiding van striatum cellen van R1117X mutant muizen komt de dikste band
overeen met de verwachte 122 kDa
Vervolgens hebben ze RNAseq uitgevoerd om te kijken of de non-sense mutatie het
expressieniveau heeft aangepast.
e. t/m h, je ziet dat InsG3680+/+ muizen bijna geen SHANK3 mRNA tot expressie brengen
voor alle probes die gebruikt zijn. De R1117X+/+ muizen tonen veel hogere mRNA
levels dan de InsG3680+/+ muizen en het mRNA van deze muizen is dus stabieler.
Aantekeningen bespreking
Doel: mutatie laten zien die ze hebben aangebracht en of het gewerkt heeft
A. Laat zien wat ze wilden doen
B. Hier zie je wat ze dan precies doen in het DNA
C. Je ziet bij de KO dat ze het eiwit indd niet hebben. Bij de homozygoot mutant zie je geen
Shank3 mutant.
D. Hier zie je dat de mutant wel aanwezig is bij de N-terminus aankleuring en het is dus een
verkort eiwit wat wel tot expressie komt.
E. Voor verschillende exonen gekeken om zeker te weten dat ze naar het gehele eiwit
keken ofzo.
De mRNA van G insertie is lager en daarnaast hebben ze voor de western blot alleen gekeken
naar de fractie van PSD eiwitten. Het korte InsG eiwit mist de C-staart die van belang is om
Shank3 in de PSD te houden. De volledige afwezigheid van het eiwit komt dus niet alleen
door de lagere expressie (mRNA level), maar ook door het ontbreken van de C-staart. R1117X
is nog korter, maar zie je wel een heel klein beetje in de western blot, interessant.
Als mRNA te kort of te lang is, wordt het sneller afgebroken en dat is terug te zien in de
mRNA levels.
, Figuur 2:
a. InsG3680+/+ muizen hebben een minder populatie spike respons vergeleken met hun
controle muizen (in het striatum).
b. Zie a
c. Presynaptisch zie je geen effect.
d. R1117X+/+ muizen hebben een vergelijkbare populatie spike respons als hun controle
muizen (in het striatum).*
e. Zie d
f. Presynaptisch zie je geen effect.
g. t/m J, de frequentie aan mini’s (mEPSC) is voor beide mutanten vergelijkbaar met
hun controle
h. –
i. & G tonen wel een amplitude verschil in mEPSCs van InsG3680+/+ muizen en controle
j. –
k. InsG3680+/+ muizen zijn minder interactief dan hun controle muizen.
l. Hier zie je welke gedragingen met name gereduceerd zijn.
m. Dezelfde resultaten zijn gevonden in de R1117X+/+ muizen, maar dan niet significant
n. Zie m
Aantekeningen bespreking
Doel: ze willen naar jonge muizen kijken, want ASD komt vaak al vroeg en dan in de striatum.
A. Corticale neuronen gestimuleerd en gekeken naar de reactie in het striatum. Spike is een
summatie van meerdere neuronen, want extracellulaire meting. Bij de G insertie zie je
dat de amplitude is afgenomen.
B. Je ziet hier dat de amplitude indd lager is.
C. Hier is gekeken naar de presynaptische reactie en deze is hetzelfde voor WT en mutant.
D. –
E. –
F. –
G. Ze kijken nog steeds naar het striatum maar dan naar mEPSCs.
H. –
I. Je ziet dat de InsG mutatie een vergrote mEPSC amplitude heeft. Bij een mEPSC wordt
altijd 1 vesicle afgegeven waar altijd evenveel glutamaat in zit en als de reactie groter is,
heeft de postsynaps dus wss meer receptoren of blijven deze langer open staan. Als
compensatie mechanisme maken de autisme muizen wss meer receptoren (doordat de
stimulatie amplitude dus lager is ofzo). Amplitude is puur een maat voor de hoeveelheid
receptoren en dus voor de respons, maar om een quantum af te geven heb je een
bepaalde kans en dat heeft te maken met de efficiënte van het presynaptische
compartiment. Dit heeft echter ook te maken met de hoeveelheid synapsen. Als 1
neuron heel veel input krijgt, is de frequentie hoger. Frequentie is dus niet alleen een
maat voor de presynaps efficiëntie, maar ook voor de hoeveelheid synapsen. Amplitude
is dus een maat voor postsynaptische dingen en frequentie voor presynaptisch.
J. –
K. Je ziet minder sociale events bij de ASD mutatie.
L. Hier onderverdeeld
M. Bij de schizofrenie mutant zie je dat deze trends ook wel aanwezig zijn, maar niet
significant.
N. Same als M
A t/m F was met stimulatie en dan werd naar meerdere neuronen gekeken vgm en bij
mEPSCs is alleen naar de spontane stromen gekeken. Verder kan je in de supplement zien dat
GluR1 (AMPA subunit) meer in de InsG muizen voorkomt. De InsG mutatie levert dus autisme
