Pharmaceutical Medicine
= medische en wetenschappelijke discipline die onderzoek doet naar: ontdekking, ontwikkeling,
evaluatie, registratie, opvolging en medische aspecten van de commercialisering van GM.
DRUG DESIGN AND DISCOVERY (D. COPMANS)
Bij het starten van een GM project stel je drie managementvragen:
1. Is het strategisch zinvol: is het wenselijk om dit te doen?
- Onvervulde medische nood: aandoeningen waarvoor huidige behandelingen niet bestaan of
duidelijk tekortschieten in werkzaamheid, veiligheid, gebruiksgemak of toegankelijkheid =>
zeldzame ziekten zonder therapie, of veel voorkomende aandoeningen waar PTen ondanks
therapie veel klachten overhouden
- Huidige vs. toekomstige nood: je bekijkt niet alleen hoe groot het probleem vandaag is, maar
ook hoe het zich zal ontwikkelen (VB.: door vergrijzing of toenemende resistentie tegen
antibiotica, door toekomstige oplossingen die op de markt kunnen komen…)
- Marktanalyse: je schat de grootte van de PTengroep, prijs- en vergoedingskansen,
concurrentie (bestaande en pipeline-producten) en de duur van marktexclusiviteit (octrooien,
data-exclusiviteit)
- Risico-inschatting: je weegt wetenschappelijke risico’s (faalkans), regulatoire risico’s (slagen
we voor EMA/FDA-eisen?) en commerciële risico’s (effectief voorgeschreven en vergoed?)
=> Een project is strategisch aantrekkelijk als het een duidelijke onvervulde nood aanpakt én een
realistische kans heeft op terugverdienen van de ontwikkelingskosten
2. Wetenschappelijk/technisch: kan het? => je beoordeelt of het concept
biologisch/technologisch geloofwaardig is
- Targets en modellen: je hebt een ziekte-relevant target nodig waarvan de rol in de
pathofysiologie redelijk goed is aangetoond via genetische, biochemische en farmacologische
data => CRISPR/RNAi, cel modellen, diermodellen en PT materiaal om te tonen dat modulatie
van het target het ziektefenotype verbetert
- Druggability: je kijkt of het target “druggable” is (binding pockets, juiste biochemische
eigenschappen) en of bekende chemotypes, biologics of andere modaliteiten het kunnen
beïnvloeden
- Beschikbare verbindingen en chemische ruimte: zijn er hits, leads of bekende scaffold-types
die laten zien dat je rond dit target chemisch kunt optimaliseren (potentie, selectiviteit,
ADME, toxiciteit)?
- Octrooien: je onderzoekt de patentlandscape: bestaan er blokkerende octrooien op het target
of op belangrijke chemische klassen, en is er ruimte voor een verdedigbaar nieuw octrooi
(nieuwe structuur, indicatie, vorm)?
- Positionering: wat voor soort GM:
o First-in-class: eerste middel met een nieuw werkingsmechanisme op een nieuw
target; hoog risico, maar potentieel grote beloning en marktaandeel
o Fast follower: komt kort na een first-in-class met een gelijkaardig mechanisme, maar
probeert snel marktaandeel te pakken (beter profiel of prijs)
o Best-in-class: zelfde target/mechanisme als bestaande middelen, maar duidelijk
betere parameters (werkzaamheid, veiligheid, gebruiksgemak, doseringsfrequentie,
toedieningsweg)
o Me-too: moleculen die chemisch en farmacologisch sterk lijken op een bestaand GM
en dezelfde indicatie hebben, vaak met beperkte of incrementele verbeteringen
(bijvoorbeeld iets andere bijwerkingen of farmacokinetiek)
=> De keuze beïnvloedt je onderzoeksstrategie: first-in-class vraagt zwaardere targetvalidatie en
innovatieve modellen; best-in-class/me-too legt de lat vooral bij aantoonbare voordelen ten opzichte
van de standaardbehandeling
3. Operationeel: kunnen wij het zelf doen? => Zelfs als een project strategisch én
wetenschappelijk goed is, moet je nagaan of jouw organisatie het kan uitvoeren
1
, - Mensen en expertise: heb je voldoende ervaren chemici, biologen, farmacologen, DMPK- en
tox-specialisten, klinische onderzoekers, regulatoire experten, IP-juristen en project-
managers? Bij ontbrekende expertise overweeg je samenwerking met CRO’s, academische
groepen of andere bedrijven
- Infrastructuur en faciliteiten: je hebt labo’s nodig voor synthese en biologische assays,
toegang tot dierfaciliteiten, analytische apparatuur
- Kosten en financiering: je maakt een raming over de volledige levenscyclus (van hit-finding
tot klinische fasen) en vergelijkt die met je budget en risicobereidheid
- Tijdslijn en portfolio-fit: past het project in je bestaande portfolio en planning, of gaat het te
veel resources weghalen van andere prioriteiten?
==> Het doel van Drug Discovery & Design:
- Farmacologisch actieve molecule vinden: je zoekt een stof (molecuul, biologic, peptide…) die
het gewenst effect heeft op een biologisch doelwit (receptor, enzym, ionkanaal) en daarmee
een ziekteproces beïnvloedt
- Bereiken van het doelwit in het lichaam: het is niet genoeg dat de molecule in een
reageerbuis werkt -> ze moet, na toediening aan de PT (oraal, IV, inhalatie, …), ook effectief
op de juiste plaats in het lichaam geraken: worden opgenomen -> verdeeld -> afgebroken of
uitgescheiden
- In voldoende hoeveelheden: op de plek van het target moet de concentratie van de molecule
hoog genoeg én lang genoeg aanwezig blijven om het target voldoende te bezetten en zo een
therapeutisch effect te bereiken:
o Potentie (hoe sterk bindt/werkt de stof op het target)
o Dosis en doseringsschema
o Farmacokinetiek (absorptie, distributie, metabolisme, eliminatie)
- Gewenst effect zonder toxiciteit => idealiter heeft de molecule:
o Een duidelijk positief klinisch effect (bloeddrukverlaging, minder tumorvolume, minder
pijn)
o Zo weinig mogelijk schadelijke effecten op andere processen in het lichaam (off-target
effecten, orgaantoxiciteit, immuunreacties, …) => therapeutisch venster creëren: een
dosisrange waarin de werking voldoende is maar de bijwerkingen aanvaardbaar en
beheersbaar blijven
==> In drug design wil je stoffen ontwerpen/identificeren waarvan je al vroeg sterke indicaties hebt
dat ze in vitro actief en in het echte menselijk lichaam veilig, in de juiste hoeveelheid en op de juiste
plek hun werk kunnen doen
In vitro antiproliferation assay (phenotypic approach) = celtest waarmee je meet of een nieuwe
stof de deling en groei van (meestal tumor)cellen kan remmen: kankercellen kweken ->
testcompounds toevoegen in een reeks concentraties => laten doorgroeien -> na incubatie meet je
hoeveel cellen er nog leven en/of delen met een kleurreactie, fluorescentie of luminescente read-out
=> intensiteit van het signaal is een maat voor de hoeveelheid of delingsactiviteit van de cellen =>
maat voor celgroei of -overleving -> dosis–respons-curve maken
-> Fenotypische benadering omdat je niet focust op een specifiek moleculair target (zoals een enzym
of receptor), maar puur op het zichtbare eindresultaat: de groei of deling van cellen
In vivo antitumoral assay (phenotypic approach) = proefdiermodel waarin je test of een
kandidaat-GM een tumor in een levend organisme kan remmen of verkleinen: tumorcellen worden bij
muizen of andere modellen ingebracht -> men wacht tot de tumor een bepaalde grootte heeft en
dient dan de teststof toe (verschillende doses, vaak vergeleken met een controlegroep en een
standaardmiddel) -> daarna meet men over de tijd de tumorgrootte, overleving en soms
uitzaaiingen => het resultaat is een directe indicatie of de stof in een volledig biologisch systeem
antitumorale activiteit heeft (tumorremming, reductie, verlengde overleving)
-> Fenotypische benadering omdat je vooral kijkt naar het “fenotype” (zichtbaar gedrag) van de
tumor: groeit hij trager, krimpt hij, veroorzaakt hij minder uitzaaiingen, zonder dat je moet weten
welk moleculair target de stof raakt
2
,In vitro kinase assay (enzym) (target based approach) = je isoleert een zuiver specifiek kinase-
enzym, mixt het met ATP (fosfaatdonor), een substraat (peptide/eiwit dat gefosforyleerd wordt) en
de teststof -> na korte incubatie meet je de fosforylatie (kinase-activiteit) via radioactiviteit,
fluorescentie, luminescente of ABdetectie => resultaat: dosis-respons-curve met IC₅₀ (concentratie
voor 50% remming)
-> Target-gebaseerde benadering omdat je specifiek test op interactie met een gekend enzymtarget:
een kinase (bijv. een tyrosinekinase betrokken bij kankergroei)
In vitro kinase assay (reporter cell line) (target based approach) = combineert een target-
gebaseerde aanpak met cel context: je gebruikt een speciaal gekweekte celstam die het kinase van
interesse overexpressen én een reporter-gen draagt (bijv. luciferase of GFP onder controle van een
kinase-afhankelijke promotor) => voeg de teststof toe aan de cellen; als de stof het kinase remt,
wordt de downstream-signaalroute geblokkeerd, en meet je een afname in reporter-signaal
(fluorescentie, luminescente) na incubatie
HTS (High Throughput Screening) = geautomatiseerde methode om razendsnel duizenden tot
miljoenen verbindingen te screenen op biologische activiteit, platen met robots voor pipetteren,
incuberen en meten => je automatiseert volledig het assay, zodat één robot tientallen platen per
dag kan verwerken
-> Werkt niet bij in vivo antitumoral assay: muizen of ratten zijn levende dieren die je niet kunt
automatiseren; je hebt handmatige injecties, tumor-metingen, ethische goedkeuring en wekenlange
observatie nodig
In silico drug design (PC) = gebruik van computersoftware en modellen om nieuwe GM te
ontwerpen zonder fysieke experimenten in het lab => je voert de 3D-structuur van een target-eiwit
in en screent virtueel grote bibliotheken met miljoenen verbindingen -> met moleculair docken
plaats je kandidaat-moleculen in de binding pocket van het target en bereken je de bindingsscore
(energie, waterstofbruggen, sterische passing) => shortlist van top-kandidaten met geschatte
affiniteit (pKd/IC₅₀), die je dan in HTS of in vitro test
Screening
Phenotypic drug discovery (PDD) = manier om nieuwe GM te vinden door te kijken naar wat er
gebeurt met een cel, weefsel of dier, ipv vooraf één specifiek moleculair doelwit/target te kiezen =>
je geeft een stof aan een biologisch systeem -> je observeert het effect (fenotype = wat je kan
zien/meten) -> als het effect gewenst is (kankercellen sterven), dan is de stof interessant
Voordelen:
- Je kijkt naar het geheel (target-unbiased): je start zonder vooraf een specifiek target te kiezen
=> je mist geen onverwachte werkingsmechanismen, je kan nieuwe biologische pathways
ontdekken, je hebt geen tunnelvisie
- Grotere kans op first-in-class GM: omdat je niet beperkt bent tot bekende targets
- Werkt vaak in vivo => ADME wordt indirect getest -> vaak gebeurt screening in cellen/dieren
=> daardoor zie je meteen of de stof: opgenomen (Absorptie), verdeeld (Distribution),
gemetaboliseerd (Metabolisme), uitgescheiden (Excretie)
Nadelen:
- Je kent het target niet => als je niet weet waar de stof op werkt: is het moeilijk om de
chemische structuur te verbeteren, bijwerkingen te voorspellen, het werkingsmechanisme te
begrijpen => vertraagt optimalisatie
- Lage throughput (zeker in vivo): experimenten in dieren of complexe systemen: kosten veel
tijd, zijn duur, je kan minder stoffen tegelijk testen => langzamer screeningproces
In vitro phenotyping = meten van verschillende karakteristieken van cellen:
- Cellulaire karakteristieken (morfologie, proteïne-aggregatie, glycogeen- en lipide-accumulatie,
meer apoptose)
- Fysiologische karakteristieken (elektrofysiologische read-outs)
- Moleculaire karakteristieken (transcriptoom, proteoom, epigenetische markers)
=> Biedt een veel meer gedetailleerd beeld van de effecten van een farmacon dan traditionele
single-endpoint assays
3
, Target-based Drug Discovery (TDD): methode om GM te ontwikkelen waarbij je vertrekt van een
specifiek biologisch doelwit (target) waarvan je al weet dat het een rol speelt in een ziekte (receptor,
enzym, ionkanaal, eiwit dat betrokken is bij ziekte) => de aanpak is dus rationeel en moleculair:
eerst mechanisme begrijpen, dan GM ontwerpen
Voordelen:
- High throughput screening mogelijk: omdat je werkt met één duidelijk target: kan je snelle
testmethoden ontwikkelen, je kan heel veel stoffen tegelijk testen, resultaten zijn makkelijk te
meten en kwantificeren
- Monoclonale ABs (MoAbs) zijn mogelijk -> bij deze aanpak kan je niet alleen: remmers
(inhibitors) en activatoren maken, maar ook: biologische therapieën zoals monoclonale ABs
- Rationeel en logisch aantrekkelijk: logisch opgebouwd, gebaseerd op mechanistisch inzicht,
voorspelbaar
Nadelen:
- Target-validatie is moeilijk: een target kan in theorie belangrijk lijken, maar: misschien is het
in het echte lichaam minder relevant, ziekte is vaak complex en multifactorieel, het target
werkt anders in een volledig organisme => werken op één target garandeert niet dat het GM
effectief is
- Te sterke focus op één ding (tunnelvisie) -> omdat je vertrekt van één target: kijk je minder
naar het hele systeem, mis je soms andere belangrijke mechanismen => kan leiden tot: me-
too drugs => minder kans op echt nieuwe werkingsmechanismen, minder innovatie dan bij
phenotypic discovery
Structure-Based Drug Design = methode om GM te ontwikkelen waarbij men de 3D-structuur van
het target-eiwit kent en gebruikt om gericht een GM te ontwerpen => in plaats van willekeurig
stoffen te testen, ga je letterlijk een molecule ontwerpen die precies past in het target (subtype van
target-based drug discovery)
-> Eerst wordt de 3D-structuur van het target bepaald (X-ray kristallografie of cryo-EM) -> je kijkt
waar: de bindings-plaats zit, welke AZ belangrijk zijn, welke interacties mogelijk zijn -> vervolgens
ontwerpen onderzoekers moleculen die: perfect in de binding pocket passen, sterke interacties
vormen (met computermodellen)
=> Je ziet eerst hoe het slot eruitziet, en maakt dan een sleutel op maat
Voordelen:
- Zeer gericht ontwerp: hoge specificiteit, minder trial-and-error, sneller optimaliseren van
moleculen
- Computergestuurd: virtuele screening mogelijk, minder experimenten nodig, bespaart tijd en
geld
- Sterke binding: je ziet precies waar interacties moeten gebeuren en hoe de binding versterkt
kan worden
Nadelen
- Je moet de structuur kennen -> veel targets hebben geen bekende 3D-structuur en/of
sommige eiwitten zijn moeilijk te kristalliseren
- Structuur is niet altijd realistisch: de structuur die je ziet: is vaak statisch terwijl eiwitten in
werkelijkheid bewegen => dus een molecule die perfect lijkt te passen: werkt soms toch niet
in vivo
-> Hoe kunnen we translatability verbeteren:
- Geen exogene stimuli gebruiken -> exogeen = nooit de echte oorzaak
- 3D cellulaire modellen in 2D (want complexer) en co-cultuur ipv 1-cell type cultuur (relevanter
voor ziektes)
- Primary cells gebruiken (cell geïsoleerd van ons weefsel van interesse) ipv commerciële
beschikbare cellen => representatiever // pluripotente stamcellen gebruiken -> kunnen voor
meerdere modellen en meerdere PTen
- Molecular phenotyping: je kijkt naar een geheel van karakteristieken (ipv een individuele
observatie)
4
= medische en wetenschappelijke discipline die onderzoek doet naar: ontdekking, ontwikkeling,
evaluatie, registratie, opvolging en medische aspecten van de commercialisering van GM.
DRUG DESIGN AND DISCOVERY (D. COPMANS)
Bij het starten van een GM project stel je drie managementvragen:
1. Is het strategisch zinvol: is het wenselijk om dit te doen?
- Onvervulde medische nood: aandoeningen waarvoor huidige behandelingen niet bestaan of
duidelijk tekortschieten in werkzaamheid, veiligheid, gebruiksgemak of toegankelijkheid =>
zeldzame ziekten zonder therapie, of veel voorkomende aandoeningen waar PTen ondanks
therapie veel klachten overhouden
- Huidige vs. toekomstige nood: je bekijkt niet alleen hoe groot het probleem vandaag is, maar
ook hoe het zich zal ontwikkelen (VB.: door vergrijzing of toenemende resistentie tegen
antibiotica, door toekomstige oplossingen die op de markt kunnen komen…)
- Marktanalyse: je schat de grootte van de PTengroep, prijs- en vergoedingskansen,
concurrentie (bestaande en pipeline-producten) en de duur van marktexclusiviteit (octrooien,
data-exclusiviteit)
- Risico-inschatting: je weegt wetenschappelijke risico’s (faalkans), regulatoire risico’s (slagen
we voor EMA/FDA-eisen?) en commerciële risico’s (effectief voorgeschreven en vergoed?)
=> Een project is strategisch aantrekkelijk als het een duidelijke onvervulde nood aanpakt én een
realistische kans heeft op terugverdienen van de ontwikkelingskosten
2. Wetenschappelijk/technisch: kan het? => je beoordeelt of het concept
biologisch/technologisch geloofwaardig is
- Targets en modellen: je hebt een ziekte-relevant target nodig waarvan de rol in de
pathofysiologie redelijk goed is aangetoond via genetische, biochemische en farmacologische
data => CRISPR/RNAi, cel modellen, diermodellen en PT materiaal om te tonen dat modulatie
van het target het ziektefenotype verbetert
- Druggability: je kijkt of het target “druggable” is (binding pockets, juiste biochemische
eigenschappen) en of bekende chemotypes, biologics of andere modaliteiten het kunnen
beïnvloeden
- Beschikbare verbindingen en chemische ruimte: zijn er hits, leads of bekende scaffold-types
die laten zien dat je rond dit target chemisch kunt optimaliseren (potentie, selectiviteit,
ADME, toxiciteit)?
- Octrooien: je onderzoekt de patentlandscape: bestaan er blokkerende octrooien op het target
of op belangrijke chemische klassen, en is er ruimte voor een verdedigbaar nieuw octrooi
(nieuwe structuur, indicatie, vorm)?
- Positionering: wat voor soort GM:
o First-in-class: eerste middel met een nieuw werkingsmechanisme op een nieuw
target; hoog risico, maar potentieel grote beloning en marktaandeel
o Fast follower: komt kort na een first-in-class met een gelijkaardig mechanisme, maar
probeert snel marktaandeel te pakken (beter profiel of prijs)
o Best-in-class: zelfde target/mechanisme als bestaande middelen, maar duidelijk
betere parameters (werkzaamheid, veiligheid, gebruiksgemak, doseringsfrequentie,
toedieningsweg)
o Me-too: moleculen die chemisch en farmacologisch sterk lijken op een bestaand GM
en dezelfde indicatie hebben, vaak met beperkte of incrementele verbeteringen
(bijvoorbeeld iets andere bijwerkingen of farmacokinetiek)
=> De keuze beïnvloedt je onderzoeksstrategie: first-in-class vraagt zwaardere targetvalidatie en
innovatieve modellen; best-in-class/me-too legt de lat vooral bij aantoonbare voordelen ten opzichte
van de standaardbehandeling
3. Operationeel: kunnen wij het zelf doen? => Zelfs als een project strategisch én
wetenschappelijk goed is, moet je nagaan of jouw organisatie het kan uitvoeren
1
, - Mensen en expertise: heb je voldoende ervaren chemici, biologen, farmacologen, DMPK- en
tox-specialisten, klinische onderzoekers, regulatoire experten, IP-juristen en project-
managers? Bij ontbrekende expertise overweeg je samenwerking met CRO’s, academische
groepen of andere bedrijven
- Infrastructuur en faciliteiten: je hebt labo’s nodig voor synthese en biologische assays,
toegang tot dierfaciliteiten, analytische apparatuur
- Kosten en financiering: je maakt een raming over de volledige levenscyclus (van hit-finding
tot klinische fasen) en vergelijkt die met je budget en risicobereidheid
- Tijdslijn en portfolio-fit: past het project in je bestaande portfolio en planning, of gaat het te
veel resources weghalen van andere prioriteiten?
==> Het doel van Drug Discovery & Design:
- Farmacologisch actieve molecule vinden: je zoekt een stof (molecuul, biologic, peptide…) die
het gewenst effect heeft op een biologisch doelwit (receptor, enzym, ionkanaal) en daarmee
een ziekteproces beïnvloedt
- Bereiken van het doelwit in het lichaam: het is niet genoeg dat de molecule in een
reageerbuis werkt -> ze moet, na toediening aan de PT (oraal, IV, inhalatie, …), ook effectief
op de juiste plaats in het lichaam geraken: worden opgenomen -> verdeeld -> afgebroken of
uitgescheiden
- In voldoende hoeveelheden: op de plek van het target moet de concentratie van de molecule
hoog genoeg én lang genoeg aanwezig blijven om het target voldoende te bezetten en zo een
therapeutisch effect te bereiken:
o Potentie (hoe sterk bindt/werkt de stof op het target)
o Dosis en doseringsschema
o Farmacokinetiek (absorptie, distributie, metabolisme, eliminatie)
- Gewenst effect zonder toxiciteit => idealiter heeft de molecule:
o Een duidelijk positief klinisch effect (bloeddrukverlaging, minder tumorvolume, minder
pijn)
o Zo weinig mogelijk schadelijke effecten op andere processen in het lichaam (off-target
effecten, orgaantoxiciteit, immuunreacties, …) => therapeutisch venster creëren: een
dosisrange waarin de werking voldoende is maar de bijwerkingen aanvaardbaar en
beheersbaar blijven
==> In drug design wil je stoffen ontwerpen/identificeren waarvan je al vroeg sterke indicaties hebt
dat ze in vitro actief en in het echte menselijk lichaam veilig, in de juiste hoeveelheid en op de juiste
plek hun werk kunnen doen
In vitro antiproliferation assay (phenotypic approach) = celtest waarmee je meet of een nieuwe
stof de deling en groei van (meestal tumor)cellen kan remmen: kankercellen kweken ->
testcompounds toevoegen in een reeks concentraties => laten doorgroeien -> na incubatie meet je
hoeveel cellen er nog leven en/of delen met een kleurreactie, fluorescentie of luminescente read-out
=> intensiteit van het signaal is een maat voor de hoeveelheid of delingsactiviteit van de cellen =>
maat voor celgroei of -overleving -> dosis–respons-curve maken
-> Fenotypische benadering omdat je niet focust op een specifiek moleculair target (zoals een enzym
of receptor), maar puur op het zichtbare eindresultaat: de groei of deling van cellen
In vivo antitumoral assay (phenotypic approach) = proefdiermodel waarin je test of een
kandidaat-GM een tumor in een levend organisme kan remmen of verkleinen: tumorcellen worden bij
muizen of andere modellen ingebracht -> men wacht tot de tumor een bepaalde grootte heeft en
dient dan de teststof toe (verschillende doses, vaak vergeleken met een controlegroep en een
standaardmiddel) -> daarna meet men over de tijd de tumorgrootte, overleving en soms
uitzaaiingen => het resultaat is een directe indicatie of de stof in een volledig biologisch systeem
antitumorale activiteit heeft (tumorremming, reductie, verlengde overleving)
-> Fenotypische benadering omdat je vooral kijkt naar het “fenotype” (zichtbaar gedrag) van de
tumor: groeit hij trager, krimpt hij, veroorzaakt hij minder uitzaaiingen, zonder dat je moet weten
welk moleculair target de stof raakt
2
,In vitro kinase assay (enzym) (target based approach) = je isoleert een zuiver specifiek kinase-
enzym, mixt het met ATP (fosfaatdonor), een substraat (peptide/eiwit dat gefosforyleerd wordt) en
de teststof -> na korte incubatie meet je de fosforylatie (kinase-activiteit) via radioactiviteit,
fluorescentie, luminescente of ABdetectie => resultaat: dosis-respons-curve met IC₅₀ (concentratie
voor 50% remming)
-> Target-gebaseerde benadering omdat je specifiek test op interactie met een gekend enzymtarget:
een kinase (bijv. een tyrosinekinase betrokken bij kankergroei)
In vitro kinase assay (reporter cell line) (target based approach) = combineert een target-
gebaseerde aanpak met cel context: je gebruikt een speciaal gekweekte celstam die het kinase van
interesse overexpressen én een reporter-gen draagt (bijv. luciferase of GFP onder controle van een
kinase-afhankelijke promotor) => voeg de teststof toe aan de cellen; als de stof het kinase remt,
wordt de downstream-signaalroute geblokkeerd, en meet je een afname in reporter-signaal
(fluorescentie, luminescente) na incubatie
HTS (High Throughput Screening) = geautomatiseerde methode om razendsnel duizenden tot
miljoenen verbindingen te screenen op biologische activiteit, platen met robots voor pipetteren,
incuberen en meten => je automatiseert volledig het assay, zodat één robot tientallen platen per
dag kan verwerken
-> Werkt niet bij in vivo antitumoral assay: muizen of ratten zijn levende dieren die je niet kunt
automatiseren; je hebt handmatige injecties, tumor-metingen, ethische goedkeuring en wekenlange
observatie nodig
In silico drug design (PC) = gebruik van computersoftware en modellen om nieuwe GM te
ontwerpen zonder fysieke experimenten in het lab => je voert de 3D-structuur van een target-eiwit
in en screent virtueel grote bibliotheken met miljoenen verbindingen -> met moleculair docken
plaats je kandidaat-moleculen in de binding pocket van het target en bereken je de bindingsscore
(energie, waterstofbruggen, sterische passing) => shortlist van top-kandidaten met geschatte
affiniteit (pKd/IC₅₀), die je dan in HTS of in vitro test
Screening
Phenotypic drug discovery (PDD) = manier om nieuwe GM te vinden door te kijken naar wat er
gebeurt met een cel, weefsel of dier, ipv vooraf één specifiek moleculair doelwit/target te kiezen =>
je geeft een stof aan een biologisch systeem -> je observeert het effect (fenotype = wat je kan
zien/meten) -> als het effect gewenst is (kankercellen sterven), dan is de stof interessant
Voordelen:
- Je kijkt naar het geheel (target-unbiased): je start zonder vooraf een specifiek target te kiezen
=> je mist geen onverwachte werkingsmechanismen, je kan nieuwe biologische pathways
ontdekken, je hebt geen tunnelvisie
- Grotere kans op first-in-class GM: omdat je niet beperkt bent tot bekende targets
- Werkt vaak in vivo => ADME wordt indirect getest -> vaak gebeurt screening in cellen/dieren
=> daardoor zie je meteen of de stof: opgenomen (Absorptie), verdeeld (Distribution),
gemetaboliseerd (Metabolisme), uitgescheiden (Excretie)
Nadelen:
- Je kent het target niet => als je niet weet waar de stof op werkt: is het moeilijk om de
chemische structuur te verbeteren, bijwerkingen te voorspellen, het werkingsmechanisme te
begrijpen => vertraagt optimalisatie
- Lage throughput (zeker in vivo): experimenten in dieren of complexe systemen: kosten veel
tijd, zijn duur, je kan minder stoffen tegelijk testen => langzamer screeningproces
In vitro phenotyping = meten van verschillende karakteristieken van cellen:
- Cellulaire karakteristieken (morfologie, proteïne-aggregatie, glycogeen- en lipide-accumulatie,
meer apoptose)
- Fysiologische karakteristieken (elektrofysiologische read-outs)
- Moleculaire karakteristieken (transcriptoom, proteoom, epigenetische markers)
=> Biedt een veel meer gedetailleerd beeld van de effecten van een farmacon dan traditionele
single-endpoint assays
3
, Target-based Drug Discovery (TDD): methode om GM te ontwikkelen waarbij je vertrekt van een
specifiek biologisch doelwit (target) waarvan je al weet dat het een rol speelt in een ziekte (receptor,
enzym, ionkanaal, eiwit dat betrokken is bij ziekte) => de aanpak is dus rationeel en moleculair:
eerst mechanisme begrijpen, dan GM ontwerpen
Voordelen:
- High throughput screening mogelijk: omdat je werkt met één duidelijk target: kan je snelle
testmethoden ontwikkelen, je kan heel veel stoffen tegelijk testen, resultaten zijn makkelijk te
meten en kwantificeren
- Monoclonale ABs (MoAbs) zijn mogelijk -> bij deze aanpak kan je niet alleen: remmers
(inhibitors) en activatoren maken, maar ook: biologische therapieën zoals monoclonale ABs
- Rationeel en logisch aantrekkelijk: logisch opgebouwd, gebaseerd op mechanistisch inzicht,
voorspelbaar
Nadelen:
- Target-validatie is moeilijk: een target kan in theorie belangrijk lijken, maar: misschien is het
in het echte lichaam minder relevant, ziekte is vaak complex en multifactorieel, het target
werkt anders in een volledig organisme => werken op één target garandeert niet dat het GM
effectief is
- Te sterke focus op één ding (tunnelvisie) -> omdat je vertrekt van één target: kijk je minder
naar het hele systeem, mis je soms andere belangrijke mechanismen => kan leiden tot: me-
too drugs => minder kans op echt nieuwe werkingsmechanismen, minder innovatie dan bij
phenotypic discovery
Structure-Based Drug Design = methode om GM te ontwikkelen waarbij men de 3D-structuur van
het target-eiwit kent en gebruikt om gericht een GM te ontwerpen => in plaats van willekeurig
stoffen te testen, ga je letterlijk een molecule ontwerpen die precies past in het target (subtype van
target-based drug discovery)
-> Eerst wordt de 3D-structuur van het target bepaald (X-ray kristallografie of cryo-EM) -> je kijkt
waar: de bindings-plaats zit, welke AZ belangrijk zijn, welke interacties mogelijk zijn -> vervolgens
ontwerpen onderzoekers moleculen die: perfect in de binding pocket passen, sterke interacties
vormen (met computermodellen)
=> Je ziet eerst hoe het slot eruitziet, en maakt dan een sleutel op maat
Voordelen:
- Zeer gericht ontwerp: hoge specificiteit, minder trial-and-error, sneller optimaliseren van
moleculen
- Computergestuurd: virtuele screening mogelijk, minder experimenten nodig, bespaart tijd en
geld
- Sterke binding: je ziet precies waar interacties moeten gebeuren en hoe de binding versterkt
kan worden
Nadelen
- Je moet de structuur kennen -> veel targets hebben geen bekende 3D-structuur en/of
sommige eiwitten zijn moeilijk te kristalliseren
- Structuur is niet altijd realistisch: de structuur die je ziet: is vaak statisch terwijl eiwitten in
werkelijkheid bewegen => dus een molecule die perfect lijkt te passen: werkt soms toch niet
in vivo
-> Hoe kunnen we translatability verbeteren:
- Geen exogene stimuli gebruiken -> exogeen = nooit de echte oorzaak
- 3D cellulaire modellen in 2D (want complexer) en co-cultuur ipv 1-cell type cultuur (relevanter
voor ziektes)
- Primary cells gebruiken (cell geïsoleerd van ons weefsel van interesse) ipv commerciële
beschikbare cellen => representatiever // pluripotente stamcellen gebruiken -> kunnen voor
meerdere modellen en meerdere PTen
- Molecular phenotyping: je kijkt naar een geheel van karakteristieken (ipv een individuele
observatie)
4
