MOLECULEN – EIWITTEN EN ENZYMEN: ZELFSTUDIES
ZELFSTUDIE 1
Vraag 1: De specifieke activiteit van een eiwit is de verhouding van enzymactiviteit tot de
hoeveelheid eiwit van de enzym assay.
Vraag 2: Bij celfractionering met behulp van een ultracentrifuge wordt een homogenaat, mengsel,
van een cel, snel afgedraaid. De zwaarste componenten zakken naar beneden, waardoor je een
supernatant krijgt. Het supernatant pipetteer je af en daarmee doe je het experiment opnieuw, bij
een hogere centrifugaalkracht. Hierdoor vindt er nog een zuivering plaats. (figuur 5.1, blz. 78)
Vraag 3:
Kolomchromatografische techniek Principe
Dialyse Scheiding op basis van grootte (eiwitten en
kleine moleculen)
Gelfiltratie chromatografie Scheiding op basis van grootte (grote en kleine
eiwitten)
Ion-exchange chromatografie Scheiding op basis van lading
Affiniteitschromatografie Scheiding op basis van affiniteit/antilichamen
Hogedrukvloeistof chromatografie Scheiding op basis van affiniteit
Vraag 4:
Gel-elektroforese techniek Principe
SDS-PAGE Scheiding op basis van grootte
Isoelectrische focusing Scheiding op basis van iso-elektrisch punt
Two-dimensional electrophoresis Scheiding op basis van grootte en iso-elektrisch punt
Vraag 5: SDS denatureert eiwitten en bindt zich aan het gedenatureerde eiwit. Doordat SDS zelf
negatief geladen is, worden alle eiwitten ook negatief geladen. Beta-mercaptoethanol verminderd
disulfidebindingen om eiwitten te lineariseren.
Vraag 6: Nee, ik zou de porie-grootte aanpassen aan de gewenste scheiding. Voor oplossing A zou ik
18% Tris-HCl gebruiken en voor oplossing B 5% Tris-HCl.
Vraag 7: De sedimentcoëfficiënt (bezinkingssnelheid) is afhankelijk van:
Massa van het deeltje
Vorm van het deeltje
Dichtheid van de oplossing
Dichtheid van het deeltje
Vraag 8: Bij celfractionering met behulp van een ultracentrifuge wordt een homogenaat, mengsel,
van een cel, snel afgedraaid. De zwaarste componenten zakken naar beneden, waardoor je een
supernatant krijgt. Het supernatant pipetteer je af en daarmee doe je het experiment opnieuw, bij
een hogere centrifugaalkracht. Hierdoor vindt er nog een zuivering plaats. (figuur 5.1, blz. 78)
Vraag 9: Bij ultra-gradient centrifugatie vorm je eerst een dichtheidsgradiënt (verschillende
concentraties van een opgeloste stof). Vervolgens wordt een klein volume van een oplossing die het
mengsel van de te scheiden eiwitten bevat, waaronder het radioactief gelabelde
estradiolreceptorcomplex, boven op de dichtheidsgradiënt geplaatst. Wanneer de rotor wordt
rondgedraaid, bewegen de eiwitten door de gradiënt en worden ze van elkaar gescheiden. De
,grotere deeltjes zullen naar de onderste laag kunnen reizen, omdat ze zwaarder zijn. (figuur 5.14, blz.
85 en figuur 5.15, blz. 86)
Vraag 10: Een polyclonaal antilichaam is een mix van antilichamen die meerdere epitopen (van
hetzelfde antigen) herkennen -> meerdere epitopen op hetzelfde antigen. Een monoclonaal
antilichaam is een zuiver antilichaam dat slechts 1 epitoop herkent -> één epitoop op één antigen.
Vraag 11:
Immunoprecipitatie: Antilichamen op beads (bolletjes) binden aan alleen specifieke eiwitten in
een oplossing. Vervolgens centrifugeren (supernatant met de overige eiwitten weghalen),
wassen met buffer, elueren, scheiden en detecteren. Voorbeeld: ELISA (enzym linked
immunosorbent assay). (figuur 5.21, blz. 90)
Solid-phase immunoassay: De aanwezigheid van een eiwit in een vloeibaar monster wordt
gedetecteerd met behulp van antilichamen die gericht zijn tegen het te meten eiwit.
-> indirect ELISA: de productie van kleur geeft de hoeveelheid antilichaam tegen een specifiek
antigen aan
-> sandwich ELISA: de productie van kleur geeft de hoeveelheid antigen aan (figuur 5.22, blz. 91)
De ELISA methode is gevoelig, omdat er als snel een kleur kan ontstaan als er een antilichaam
of antigen wordt gedetecteerd. ???
Western blotting: Eiwitten op een SDS-polyacrylamidegel worden overgebracht naar een
polymeerplaat door gebruik te maken van elektriciteit en gekleurd met fluorescerend gelabelde
antlichamen (1e antilichaam en secundair antilichaam versterkt signaal). Het fluorescerende
antilichaam wordt opgewekt door licht en de band die overeenkomt met het eiwit waarin het
antlichaam bindt, wordt zichtbaar gemaakt met een geschikte detector. (figuur 5.23, blz. 91)
Vraag 12: Antilichamen kunnen worden gedetecteerd bij een fluorescentiemicroscoop als ze gelabeld
zijn met fluorescerende kleurstoffen of bij een elektronenmicroscoop als ze elektrondichte deeltjes
zoals colloïdaal goudbollen bevatten. Je zou de antilichamen (gebonden aan specifieke eiwitten)
kunnen volgen door de cel via microscopie en zou de locatie van een eiwit achterhalen.
Vraag 13: Het eiwit wordt gehydrolyseerd tot zijn samengestelde aminozuren
door het in sterk zuur te verhitten. De afzonderlijke aminozuren kunnen
worden gescheiden door ion-exchange chromatografie en gevisualiseerd door
behandeling met fluorescamine, dat reageert met de alfa-aminogroep om
een sterk fluorescerend product te vormen. De oplossing wordt vervolgens
door een kolom geleidt. De hoeveelheid buffer die nodig is om het aminozuur
uit de kolom te verwijderen, wordt vergelijken met het elutiepatroon van een
standaardmengsel van aminozuren, waardoor de identiteit van een
aminozuur in de oplossing kan worden onthuld. De volgorde kan vervolgens
worden bepaald door Edman degradatie. Hierbij wordt achtereenvolgens één
residu per keer van het amino-uiteinde van het eiwit verwijderd. Phenyl
isothiocyanate reageert met de terminale aminogroep van het eiwit, dat
vervolgens cycliseert en het eiwit afbreekt, waardoor een intact eiwit wordt verkregen dat met één
aminozuur ingekort is. (figuur 5.25&5.26, blz. 92&93)
Vraag 14: Massaspectrometrie kan worden gebruikt om de massa, identiteit en sequentie van een
eiwit te bepalen. Bij TOF analyse worden de ionen in een elektrisch veld naar een detector versneld.
De lichtere ionen worden meer versneld, reizen sneller en komen als eerste bij de detector. De
ioniserende laserpuls activeert ook een klok die de vluchttijd (TOF) van ionen meet. (figuur 5.28, blz.
95). Peptide mass fingerprinting (PMF) is een analytische techniek voor proteïne identificatie waarbij
het onbekende eiwit van belang eerst wordt gesplitst in kleinere peptiden, waarvan de absolute
massa nauwkeurig kan worden gemeten met een massaspectrometer zoals MALDI-TOF of ESI-TOF
, Vraag 15: 3D structuren worden bepaald door aminozuur sequentie en gevormd door covalente
interacties (bv. S-S brug), vanderwaalskrachten, zoutbruggen, H-bruggen, aa isometrisatie etc. 3D
structuren zijn niet te voorspellen, maar met X-ray kristallografie en Nuclear Magnetic Resonance
(NMR)spectroscopie kan je de structuur van een eiwit bepalen.
X-ray Crystallografie
- voordelen:
- beperkingen: zoeken van de juiste buffer kan maanden duren, niet alle eiwitten zijn te
kristalliseren
NMR
- voordelen: effect van bindingen tussen eiwitten te zien (veranderingen in de eiwitstructuur
volgen), niet afhankelijk van het hebben van een kristallijn monster
- beperkingen: structuur van grote eiwitten (meer dan 100.000 dalton) kan moeilijker worden
bepaald, doordat de resolutie afneemt
Vraag 16: Bij een eiwitstructuur bepaald met kristallografie heb je één conformatie (star) en bij NMR
heb je verschillende conformaties in oplossing, waardoor je ook het effect van binding tussen
eiwitten kan zien.
ZELFSTUDIE 1
Vraag 1: De specifieke activiteit van een eiwit is de verhouding van enzymactiviteit tot de
hoeveelheid eiwit van de enzym assay.
Vraag 2: Bij celfractionering met behulp van een ultracentrifuge wordt een homogenaat, mengsel,
van een cel, snel afgedraaid. De zwaarste componenten zakken naar beneden, waardoor je een
supernatant krijgt. Het supernatant pipetteer je af en daarmee doe je het experiment opnieuw, bij
een hogere centrifugaalkracht. Hierdoor vindt er nog een zuivering plaats. (figuur 5.1, blz. 78)
Vraag 3:
Kolomchromatografische techniek Principe
Dialyse Scheiding op basis van grootte (eiwitten en
kleine moleculen)
Gelfiltratie chromatografie Scheiding op basis van grootte (grote en kleine
eiwitten)
Ion-exchange chromatografie Scheiding op basis van lading
Affiniteitschromatografie Scheiding op basis van affiniteit/antilichamen
Hogedrukvloeistof chromatografie Scheiding op basis van affiniteit
Vraag 4:
Gel-elektroforese techniek Principe
SDS-PAGE Scheiding op basis van grootte
Isoelectrische focusing Scheiding op basis van iso-elektrisch punt
Two-dimensional electrophoresis Scheiding op basis van grootte en iso-elektrisch punt
Vraag 5: SDS denatureert eiwitten en bindt zich aan het gedenatureerde eiwit. Doordat SDS zelf
negatief geladen is, worden alle eiwitten ook negatief geladen. Beta-mercaptoethanol verminderd
disulfidebindingen om eiwitten te lineariseren.
Vraag 6: Nee, ik zou de porie-grootte aanpassen aan de gewenste scheiding. Voor oplossing A zou ik
18% Tris-HCl gebruiken en voor oplossing B 5% Tris-HCl.
Vraag 7: De sedimentcoëfficiënt (bezinkingssnelheid) is afhankelijk van:
Massa van het deeltje
Vorm van het deeltje
Dichtheid van de oplossing
Dichtheid van het deeltje
Vraag 8: Bij celfractionering met behulp van een ultracentrifuge wordt een homogenaat, mengsel,
van een cel, snel afgedraaid. De zwaarste componenten zakken naar beneden, waardoor je een
supernatant krijgt. Het supernatant pipetteer je af en daarmee doe je het experiment opnieuw, bij
een hogere centrifugaalkracht. Hierdoor vindt er nog een zuivering plaats. (figuur 5.1, blz. 78)
Vraag 9: Bij ultra-gradient centrifugatie vorm je eerst een dichtheidsgradiënt (verschillende
concentraties van een opgeloste stof). Vervolgens wordt een klein volume van een oplossing die het
mengsel van de te scheiden eiwitten bevat, waaronder het radioactief gelabelde
estradiolreceptorcomplex, boven op de dichtheidsgradiënt geplaatst. Wanneer de rotor wordt
rondgedraaid, bewegen de eiwitten door de gradiënt en worden ze van elkaar gescheiden. De
,grotere deeltjes zullen naar de onderste laag kunnen reizen, omdat ze zwaarder zijn. (figuur 5.14, blz.
85 en figuur 5.15, blz. 86)
Vraag 10: Een polyclonaal antilichaam is een mix van antilichamen die meerdere epitopen (van
hetzelfde antigen) herkennen -> meerdere epitopen op hetzelfde antigen. Een monoclonaal
antilichaam is een zuiver antilichaam dat slechts 1 epitoop herkent -> één epitoop op één antigen.
Vraag 11:
Immunoprecipitatie: Antilichamen op beads (bolletjes) binden aan alleen specifieke eiwitten in
een oplossing. Vervolgens centrifugeren (supernatant met de overige eiwitten weghalen),
wassen met buffer, elueren, scheiden en detecteren. Voorbeeld: ELISA (enzym linked
immunosorbent assay). (figuur 5.21, blz. 90)
Solid-phase immunoassay: De aanwezigheid van een eiwit in een vloeibaar monster wordt
gedetecteerd met behulp van antilichamen die gericht zijn tegen het te meten eiwit.
-> indirect ELISA: de productie van kleur geeft de hoeveelheid antilichaam tegen een specifiek
antigen aan
-> sandwich ELISA: de productie van kleur geeft de hoeveelheid antigen aan (figuur 5.22, blz. 91)
De ELISA methode is gevoelig, omdat er als snel een kleur kan ontstaan als er een antilichaam
of antigen wordt gedetecteerd. ???
Western blotting: Eiwitten op een SDS-polyacrylamidegel worden overgebracht naar een
polymeerplaat door gebruik te maken van elektriciteit en gekleurd met fluorescerend gelabelde
antlichamen (1e antilichaam en secundair antilichaam versterkt signaal). Het fluorescerende
antilichaam wordt opgewekt door licht en de band die overeenkomt met het eiwit waarin het
antlichaam bindt, wordt zichtbaar gemaakt met een geschikte detector. (figuur 5.23, blz. 91)
Vraag 12: Antilichamen kunnen worden gedetecteerd bij een fluorescentiemicroscoop als ze gelabeld
zijn met fluorescerende kleurstoffen of bij een elektronenmicroscoop als ze elektrondichte deeltjes
zoals colloïdaal goudbollen bevatten. Je zou de antilichamen (gebonden aan specifieke eiwitten)
kunnen volgen door de cel via microscopie en zou de locatie van een eiwit achterhalen.
Vraag 13: Het eiwit wordt gehydrolyseerd tot zijn samengestelde aminozuren
door het in sterk zuur te verhitten. De afzonderlijke aminozuren kunnen
worden gescheiden door ion-exchange chromatografie en gevisualiseerd door
behandeling met fluorescamine, dat reageert met de alfa-aminogroep om
een sterk fluorescerend product te vormen. De oplossing wordt vervolgens
door een kolom geleidt. De hoeveelheid buffer die nodig is om het aminozuur
uit de kolom te verwijderen, wordt vergelijken met het elutiepatroon van een
standaardmengsel van aminozuren, waardoor de identiteit van een
aminozuur in de oplossing kan worden onthuld. De volgorde kan vervolgens
worden bepaald door Edman degradatie. Hierbij wordt achtereenvolgens één
residu per keer van het amino-uiteinde van het eiwit verwijderd. Phenyl
isothiocyanate reageert met de terminale aminogroep van het eiwit, dat
vervolgens cycliseert en het eiwit afbreekt, waardoor een intact eiwit wordt verkregen dat met één
aminozuur ingekort is. (figuur 5.25&5.26, blz. 92&93)
Vraag 14: Massaspectrometrie kan worden gebruikt om de massa, identiteit en sequentie van een
eiwit te bepalen. Bij TOF analyse worden de ionen in een elektrisch veld naar een detector versneld.
De lichtere ionen worden meer versneld, reizen sneller en komen als eerste bij de detector. De
ioniserende laserpuls activeert ook een klok die de vluchttijd (TOF) van ionen meet. (figuur 5.28, blz.
95). Peptide mass fingerprinting (PMF) is een analytische techniek voor proteïne identificatie waarbij
het onbekende eiwit van belang eerst wordt gesplitst in kleinere peptiden, waarvan de absolute
massa nauwkeurig kan worden gemeten met een massaspectrometer zoals MALDI-TOF of ESI-TOF
, Vraag 15: 3D structuren worden bepaald door aminozuur sequentie en gevormd door covalente
interacties (bv. S-S brug), vanderwaalskrachten, zoutbruggen, H-bruggen, aa isometrisatie etc. 3D
structuren zijn niet te voorspellen, maar met X-ray kristallografie en Nuclear Magnetic Resonance
(NMR)spectroscopie kan je de structuur van een eiwit bepalen.
X-ray Crystallografie
- voordelen:
- beperkingen: zoeken van de juiste buffer kan maanden duren, niet alle eiwitten zijn te
kristalliseren
NMR
- voordelen: effect van bindingen tussen eiwitten te zien (veranderingen in de eiwitstructuur
volgen), niet afhankelijk van het hebben van een kristallijn monster
- beperkingen: structuur van grote eiwitten (meer dan 100.000 dalton) kan moeilijker worden
bepaald, doordat de resolutie afneemt
Vraag 16: Bij een eiwitstructuur bepaald met kristallografie heb je één conformatie (star) en bij NMR
heb je verschillende conformaties in oplossing, waardoor je ook het effect van binding tussen
eiwitten kan zien.
