Altklausurfragen
Sie haben eine Entwicklungsmutante von Aspergillus nidulans isoliert. Wie können sie
herausfinden, ob der Phänotyp durch die Mutation eines einzelnen Gens verursacht
wurde? Beschreiben sie die Vorgehensweise
• Mutante mit dem WT kreuzen -> A. nidulans hat sexuelle Fortplanzung -> lässt Stämme
(beide brauchen je 1 Zusatz zB. paba + pyro ) in Medium aufeinander zu wachsen
-> Hyphenfusion im Überschneidungsgebiet -> davon Mycel ausschneiden + auf
Minimalmedium wachsen lassen -> nur fusionierte Hyphen (Heterokaryon) haben beide
Zusätze (paba + pyro) + können überleben
• Wenn einzelnes Gen betroffen ist sind die Nachkommen 50% WT und 50% Phänotyp
• Wenn mehrere Gene betroffen sind -> sind nur 25% der Nachkommen WT
Wie finden sie heraus, ob es sich um eine bereits bekannte Mutante handelt?
• Hat verdacht welche Mutation es sein könnte
• Komplementation der Mutante mit einer fkt. Variante des kaputten Gens
• Kommt dann wieder WT raus, handelt es sich um eine bereits bekannte Mutation
Sie haben mehrrere Mutanten isoliert, die phänotypisch gleich aussehen. Wie finden sie
heraus ob alle Mutanten im gleichen Gen getroffen wurden?
• Kreuzung der Mutanten untereinander
• Wenn 100% der Nachkommen gleichen Phäno haben -> gleiches Gen getroffen
• Wenn 100% der Nachkommen Mutant, aber unterschiedlichen Phäno -> Mutationen
liegen auf gleichem Chromosom
• Kommen bei Kreuzung WT Nachkommen raus -> dann nicht identisches Gen getroffen,
sondern unterschiedliches -> können sich gegenseitig komplementieren
o Wenn 25% der Nachkommen WT -> Mutationen liegen auf versch. Chromosomen
Sie kreuzen 2 Mutanren miteinander + finden bei 100 Nachkommen 1 Stamm mit WT-
Phänotyp. Interpretieren sie das Kreuzungsergebnis.
• Rekombination des mutierten Gens -> sehr seltenes Event (Wahrscheinlichkeit bei ca
0,01%)
• Es entsteht dadurch WT restore + Mutante mit 2 Mutationen in 1 Gen
• Kann daraus schließen, dass Mutationen im gleichen Gen nah aneinander liegen
Wie bestimmen sie, ob eine Mutation dominant oder rezessiv ist? Beschreiben sie
• Diploide konstruiieren
• Hyphen von Mutante mit WT fusionieren lassen -> lässt Stämme in Medium aufeinander
zu wachsen (Mutante benötigt 1 Zusatz, WT auch) -> Hyphenfusion im
Überschneidungsgebiet -> diploide Sporen auf Minimalmedium isolieren + wachsen
• Sieht Stamm aus wie WT, handelt sich um eine rezessive Mutation -> WT kann Mutation
komplementieren
• Sieht Stamm aus wie Mutante -> dominante Mutation
,Beschreiben sie die Isolierung blinder A. nidulans Mutanten mithilfe eines lichtregulierten
Promotors.
• Stellt Stamm her, bei dem lichtregulierter Promotor zB. conJ vor pyrG Gen sitzt -> pyrG
essentiell für Wachstum
• Stamm kann nur bei Licht wachsen
• Dieser Stamm wird dann für Mutagenese verwendet + dann wird nach Mutanten
gescreent, die bei Licht nicht mehr wachsen können = sehr kleine Kolonien -> Isolation
blinder Mutanten
• Mutation kann jedoch auch wo anders liegen -> lässt isolierte Mutanten auf
uracilhaltigem Minimalmedium wachsen -> Uracil hebt fehlendes pyrG auf -> Rescue
-> Kolonien die auf Uracilmedium normal wachsen isolieren = blinde Mutanten
• Dann weitere Untersuchungen möglich: Genexpressionsanalyse ob andere lichtreg. Gene
exprimiert werden können -> wenn nicht Effektor getroffen
• Mit diesen kann man dann über Komplementation mit Cosmid Library oder mit 10-20
Mutanten NGS (davor viele Rückkreuzung mit WT) machen, um mutiertes Gen zu finden
Sie haben eine Entwicklungsmutante von A. nidulans isoliert + möchten das Gen durch
Genomsequenzierung identifizieren. Wie gehen sie vor?
• Mehrere Kreuzungen der Entwicklungsmutante mit WT um Hintergrundmutationen zu
minimieren
o Dafür nach Kreuzung immer Nachkommen mit Mutantenphäno genommen +
erneut mit WT gekreuzt -> wird ca. 3 mal wiederholt
• Danach nimmt man 10-20 Stämme mit Mutantenphänotyp + sequenziert diese
gleichzeitig mit NGS
o Dafür gDNA aus allen Stämmen entnommen -> gemischt + zsm sequenziert mit
Illumina
o Nur Mutation taucht in allen Stämmen auf -> so kann Gen identifiziert werden
Was versteht man unter einem Aktionsspektrum? Was zeigt es? Wozu macht man es?
• Definition: Abhängigkeit eines biologischen Effektes von der Wellenlänge des
eingestrahlten Lichtes
• Probe wird mit unterschiedlichen Wellenlängen bestrahlt
• Chromophore können dadurch angeregt werden + somit Photorezeptoren aktiv werden
• Unterschiede im Spektrum bzw. Zunahme/Abnahme der Absorption kann untersucht
werden
• Genutzt um Herauszufinden, welcher Entwicklungsschritt durch welche Wellenlänge
induziert bzw. welche Gene exprimiert werden
• Asexuelle Vermehrung nach Rotlichteinwirkung bei A. nidulans oder nach
Blaulichteinwirkung bei N.crassa + anderen Pilzen
• Oder Blaulicht reprimiert Mycotoxin Produktion, bei Rotlicht induziert
, Wie würden sie zur Aufreinigung eines Enzyms aus einem Rohextrakt verfahren? Wie
bestimmen sie die Gensequenz des aufgereinigten Enzyms?
• Aufreinigung eines Enzyms
o Durch Enzymassay -> dafür benötigt Substrat, welches zu Produkt umgesetzt wird
und evtl. Reduktionsäquivalente
▪ Rohextrakt enthält alle Enzyme der Zellen -> Separieren in Kolumnen ->
durch versch. Konz. des Elutionsmittels -> Fraktionierung der Enzyme
▪ Dann kann man Abnahme Substrat oder Zunahme Produkt (am besten
fluoreszentes Produkt verwenden) messen oder Enzymaktivität
untersuchen (NAD/NADH Assay) mit fraktionierten Enzymen
▪ Gefundenes Enzym aus Fraktion aufreinigen dazu versch.
Chromatographien bzw. Trennprinzipien nacheinanderschalten oder
durch HPLC
▪ Dann Aufreinigung mit SDS-Gel überprüfen
• Gensequenz des aufgereinigten Enzyms bestimmen -> versch. Möglichkeiten
o Bande aus SDS Gel ausschneiden + Protein N-terminal ansequenzieren = Edman
Abbau
▪ Ca. 20 AS des Proteins sequenziert
▪ Kann aus diesen AS degenerierten Oligonukleotidprimer erstellen
▪ Primer in PCR einsetzen mit genomischer DNA -> kurzes DNA Stück wird
amplifiziert -> passt perfekt auf die Sequenz
▪ Kann markiert werden + als Sonde für Hybridisierung eingesetzt werden
▪ Vgl mit Genbank -> durch Southern Blot oder durch Kolonie Hybridisation
richtiges Gen finden + isolieren
• Kolonie Hybridisation: Library des Genoms angelegt in E.coli
-> dann Nitrocellulosemembran drauf + wieder removed -> auf
Membran sind die Kolonien mit den DNA-Fragmenten -> dann
Hybridisierung mit markierter Sonde -> Kolonie mit target DNA
isolieren = Genisolation
o Peptide Fingerprint
▪ Genom muss dafür sequenziert sein
▪ Protein mit Trypsin verdauen -> schneidet Protein in viele versch. Peptide
-> diese Peptide sind spezifisch für das Protein
▪ Dann Maldi Tof (Massenspektrometrie) -> damit erhält man Massen der
Peptide -> Peaks sind charakteristisch für das Protein = Fingerprint
▪ Vgl mit Genomdatenbank -> kann im PC alle OPFs in Proteine übersetzten
+ mit Trypsin verdauen -> findet dann durch Vergleich das
charakteristische Protein + weiß welches Gen es erzeugt
Sie haben eine Entwicklungsmutante von Aspergillus nidulans isoliert. Wie können sie
herausfinden, ob der Phänotyp durch die Mutation eines einzelnen Gens verursacht
wurde? Beschreiben sie die Vorgehensweise
• Mutante mit dem WT kreuzen -> A. nidulans hat sexuelle Fortplanzung -> lässt Stämme
(beide brauchen je 1 Zusatz zB. paba + pyro ) in Medium aufeinander zu wachsen
-> Hyphenfusion im Überschneidungsgebiet -> davon Mycel ausschneiden + auf
Minimalmedium wachsen lassen -> nur fusionierte Hyphen (Heterokaryon) haben beide
Zusätze (paba + pyro) + können überleben
• Wenn einzelnes Gen betroffen ist sind die Nachkommen 50% WT und 50% Phänotyp
• Wenn mehrere Gene betroffen sind -> sind nur 25% der Nachkommen WT
Wie finden sie heraus, ob es sich um eine bereits bekannte Mutante handelt?
• Hat verdacht welche Mutation es sein könnte
• Komplementation der Mutante mit einer fkt. Variante des kaputten Gens
• Kommt dann wieder WT raus, handelt es sich um eine bereits bekannte Mutation
Sie haben mehrrere Mutanten isoliert, die phänotypisch gleich aussehen. Wie finden sie
heraus ob alle Mutanten im gleichen Gen getroffen wurden?
• Kreuzung der Mutanten untereinander
• Wenn 100% der Nachkommen gleichen Phäno haben -> gleiches Gen getroffen
• Wenn 100% der Nachkommen Mutant, aber unterschiedlichen Phäno -> Mutationen
liegen auf gleichem Chromosom
• Kommen bei Kreuzung WT Nachkommen raus -> dann nicht identisches Gen getroffen,
sondern unterschiedliches -> können sich gegenseitig komplementieren
o Wenn 25% der Nachkommen WT -> Mutationen liegen auf versch. Chromosomen
Sie kreuzen 2 Mutanren miteinander + finden bei 100 Nachkommen 1 Stamm mit WT-
Phänotyp. Interpretieren sie das Kreuzungsergebnis.
• Rekombination des mutierten Gens -> sehr seltenes Event (Wahrscheinlichkeit bei ca
0,01%)
• Es entsteht dadurch WT restore + Mutante mit 2 Mutationen in 1 Gen
• Kann daraus schließen, dass Mutationen im gleichen Gen nah aneinander liegen
Wie bestimmen sie, ob eine Mutation dominant oder rezessiv ist? Beschreiben sie
• Diploide konstruiieren
• Hyphen von Mutante mit WT fusionieren lassen -> lässt Stämme in Medium aufeinander
zu wachsen (Mutante benötigt 1 Zusatz, WT auch) -> Hyphenfusion im
Überschneidungsgebiet -> diploide Sporen auf Minimalmedium isolieren + wachsen
• Sieht Stamm aus wie WT, handelt sich um eine rezessive Mutation -> WT kann Mutation
komplementieren
• Sieht Stamm aus wie Mutante -> dominante Mutation
,Beschreiben sie die Isolierung blinder A. nidulans Mutanten mithilfe eines lichtregulierten
Promotors.
• Stellt Stamm her, bei dem lichtregulierter Promotor zB. conJ vor pyrG Gen sitzt -> pyrG
essentiell für Wachstum
• Stamm kann nur bei Licht wachsen
• Dieser Stamm wird dann für Mutagenese verwendet + dann wird nach Mutanten
gescreent, die bei Licht nicht mehr wachsen können = sehr kleine Kolonien -> Isolation
blinder Mutanten
• Mutation kann jedoch auch wo anders liegen -> lässt isolierte Mutanten auf
uracilhaltigem Minimalmedium wachsen -> Uracil hebt fehlendes pyrG auf -> Rescue
-> Kolonien die auf Uracilmedium normal wachsen isolieren = blinde Mutanten
• Dann weitere Untersuchungen möglich: Genexpressionsanalyse ob andere lichtreg. Gene
exprimiert werden können -> wenn nicht Effektor getroffen
• Mit diesen kann man dann über Komplementation mit Cosmid Library oder mit 10-20
Mutanten NGS (davor viele Rückkreuzung mit WT) machen, um mutiertes Gen zu finden
Sie haben eine Entwicklungsmutante von A. nidulans isoliert + möchten das Gen durch
Genomsequenzierung identifizieren. Wie gehen sie vor?
• Mehrere Kreuzungen der Entwicklungsmutante mit WT um Hintergrundmutationen zu
minimieren
o Dafür nach Kreuzung immer Nachkommen mit Mutantenphäno genommen +
erneut mit WT gekreuzt -> wird ca. 3 mal wiederholt
• Danach nimmt man 10-20 Stämme mit Mutantenphänotyp + sequenziert diese
gleichzeitig mit NGS
o Dafür gDNA aus allen Stämmen entnommen -> gemischt + zsm sequenziert mit
Illumina
o Nur Mutation taucht in allen Stämmen auf -> so kann Gen identifiziert werden
Was versteht man unter einem Aktionsspektrum? Was zeigt es? Wozu macht man es?
• Definition: Abhängigkeit eines biologischen Effektes von der Wellenlänge des
eingestrahlten Lichtes
• Probe wird mit unterschiedlichen Wellenlängen bestrahlt
• Chromophore können dadurch angeregt werden + somit Photorezeptoren aktiv werden
• Unterschiede im Spektrum bzw. Zunahme/Abnahme der Absorption kann untersucht
werden
• Genutzt um Herauszufinden, welcher Entwicklungsschritt durch welche Wellenlänge
induziert bzw. welche Gene exprimiert werden
• Asexuelle Vermehrung nach Rotlichteinwirkung bei A. nidulans oder nach
Blaulichteinwirkung bei N.crassa + anderen Pilzen
• Oder Blaulicht reprimiert Mycotoxin Produktion, bei Rotlicht induziert
, Wie würden sie zur Aufreinigung eines Enzyms aus einem Rohextrakt verfahren? Wie
bestimmen sie die Gensequenz des aufgereinigten Enzyms?
• Aufreinigung eines Enzyms
o Durch Enzymassay -> dafür benötigt Substrat, welches zu Produkt umgesetzt wird
und evtl. Reduktionsäquivalente
▪ Rohextrakt enthält alle Enzyme der Zellen -> Separieren in Kolumnen ->
durch versch. Konz. des Elutionsmittels -> Fraktionierung der Enzyme
▪ Dann kann man Abnahme Substrat oder Zunahme Produkt (am besten
fluoreszentes Produkt verwenden) messen oder Enzymaktivität
untersuchen (NAD/NADH Assay) mit fraktionierten Enzymen
▪ Gefundenes Enzym aus Fraktion aufreinigen dazu versch.
Chromatographien bzw. Trennprinzipien nacheinanderschalten oder
durch HPLC
▪ Dann Aufreinigung mit SDS-Gel überprüfen
• Gensequenz des aufgereinigten Enzyms bestimmen -> versch. Möglichkeiten
o Bande aus SDS Gel ausschneiden + Protein N-terminal ansequenzieren = Edman
Abbau
▪ Ca. 20 AS des Proteins sequenziert
▪ Kann aus diesen AS degenerierten Oligonukleotidprimer erstellen
▪ Primer in PCR einsetzen mit genomischer DNA -> kurzes DNA Stück wird
amplifiziert -> passt perfekt auf die Sequenz
▪ Kann markiert werden + als Sonde für Hybridisierung eingesetzt werden
▪ Vgl mit Genbank -> durch Southern Blot oder durch Kolonie Hybridisation
richtiges Gen finden + isolieren
• Kolonie Hybridisation: Library des Genoms angelegt in E.coli
-> dann Nitrocellulosemembran drauf + wieder removed -> auf
Membran sind die Kolonien mit den DNA-Fragmenten -> dann
Hybridisierung mit markierter Sonde -> Kolonie mit target DNA
isolieren = Genisolation
o Peptide Fingerprint
▪ Genom muss dafür sequenziert sein
▪ Protein mit Trypsin verdauen -> schneidet Protein in viele versch. Peptide
-> diese Peptide sind spezifisch für das Protein
▪ Dann Maldi Tof (Massenspektrometrie) -> damit erhält man Massen der
Peptide -> Peaks sind charakteristisch für das Protein = Fingerprint
▪ Vgl mit Genomdatenbank -> kann im PC alle OPFs in Proteine übersetzten
+ mit Trypsin verdauen -> findet dann durch Vergleich das
charakteristische Protein + weiß welches Gen es erzeugt
