Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung…………………………………………………………………………………………...3-4
2. Zielsetzung…………………………………………………………………………………………....5
3. Material und Methoden …………………………………………………………………………….6-7
3.1 Transformation von E. coli……………………………………………………………….....6
3.1.1 Transformation…………………………………………………………………...6
3.1.2 Plasmidpräparation……………………………………………………………….6
3.1.3 Agarose Gelelektrophorese…………………………………………………….…6
3.1.4 Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung…………….….6
3.2 Biolistische Transformation………………………………………………………………6-7
3.2.1 Vorbereitung der Goldpartikel…………………………………………………....6
3.2.2 Beladen der Partikel mit Plasmid-DNA…………………………………………..6
3.2.3 Biolistische Transformation……………………………………………………...7
3.2.4 Fluoreszenzmikroskopie………………………………………………………….7
4. Ergebnisse…………………………………………………………………………………………..8-9
4.1 Transformation von E. coli – Analyse der Elutionsfraktion………………………………....8
4.1.1 Agarose Gelelektrophorese……………………………………………………….8
4.1.2 Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung………………...8
4.2 Biolistische Transformation………………………………………………………………...9
4.2.1 Fluoreszenzmikroskopie………………………………………………………….9
5. Diskussion………………………………………………………………………………………..10-13
5.1 Transformation von E. coli – Analyse der Elutionsfraktion……………………………10-11
5.1.1 Agarose Gelelektrophorese………………………………………………….…..10
5.1.2. Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung…………..10-11
5.2 Biolistische Transformation……………………………………………………………….11
5.2.1 Fluoreszenzmikroskopie…………………………………………………….…..11
5.3 Eigene Meinung zur Gentechnik……………………………………………………….12-13
6. Literatur………………………………………………………………………………………….…..14
2
, 1. Einleitung
Die Biolistische Transformation beschreibt die Aufnahme von ballistisch zugeführter Fremd-DNA
durch Zellen, ihr Name leitet sich vom englischen Ausdruck biological ballistic transformation ab. Sie
stellt eine einfache und schnelle Methode zur Erzeugung gentechnisch veränderter Zellen oder
Organismen dar, da die Methode ein breites Anwendungsspektrum hat lässt sie sich für eine Vielzahl
von Organismen einsetzen. Damit hat sie einen enormen Vorteil gegenüber der Transformation mit
Agrobacterium tumefaciens und der Protoplastentransformation, da diese nur bei einigen Arten
Anwendung finden.
Mit der Biolistischen Transformation wird Fremd-DNA in Zellen eingebracht und dort exprimiert, die
Transformation kann hierbei stabil oder transient erfolgen. Bei der stabilen Transformation wird die
Fremd-DNA in das Genom integriert, dadurch wird es an die Nachkommen weitergegeben und somit
dauerhaft im Genom fixiert. Dies kann sowohl im Kerngenom als auch im Mitochondrien- oder
Plastidgenom stattfinden. Die Fixierung im Mitochondriengenom ist überaus hilfreich, da die
Mitochondrien nur mütterlicherseits weitergegeben werden (Eva-Effekt) und somit eine unkontrollierte
Streuung der transformierten DNA verhindert werden kann. Die transiente Transformation ist zeitlich
begrenzt, da hier die DNA nicht in das Genom integriert wird geht der Effekt wieder verloren und
etabliert sich nicht unter den Nachkommen. Dies ist oft der Fall bei der Biolistischen Transformation,
aufgrund dessen eignet sie sich für Interaktionsstudien, Promotorstudien und zur Untersuchung
zellulärer Proteinlokalisation.
Um die Fremd-DNA einzubringen muss jedoch zuerst die pflanzliche Zellwand überwunden werden,
ohne dabei die Zelle letal zu beschädigen, daher greift das Funktionsprinzip der Biolistischen
Transformation auf eine spezifische Apparatur zurück die sogenannte Partikelkanone. Mit DNA
beschichtete sehr kleine Gold- oder Wolframpartikel (Mikrocarriers) werden auf einem Makrocarrier
befestigt, dieser wird in einer Vakuumkammer stark beschleunigt und dann abrupt abgebremst, die
Mikrocarriers lösen sich ab und werden mit enorm hohem Druck auf die Probe geschossen. So wird die
DNA in die Zelle eingebracht, ohne einen dauerhaften Schaden anzurichten (3).
Die Effizienz ist jedoch von einer Vielzahl von Faktoren abhängig und bei der Biolistischen
Transformation relativ gering. Um die Transformation und den Erfolg nachweisen zu können, werden
zusammen mit der Fremd-DNA Markergene miteingebracht. Diese Markergene sind entweder
Selektionsmarker, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz miteinbringen, damit lässt sich sofort eine
Selektion gegenüber untransformierten Zellen nachweisen, oder Reportergene, deren Genprodukte
leicht biochemisch, histochemisch, mikroskopisch oder photometrisch nachweisbar sind. Das
Reportergen wird meist mit einem zweiten Gen fusioniert oder an den Promotor angeheftet, es kann
dadurch Aufschluss über die Proteinlokalisation und -interaktion geben und lässt sich gut für
Promotorstudien einsetzen. (1)
Um die Fremd-DNA einzubringen werden Vektoren benötigt. Vektoren sind mobile Elemente, mit
deren Hilfe sich Fremd-DNA zwischen zwei Organismen übertragen lässt. Zu dieser Gruppe zählen die
3
1. Einleitung…………………………………………………………………………………………...3-4
2. Zielsetzung…………………………………………………………………………………………....5
3. Material und Methoden …………………………………………………………………………….6-7
3.1 Transformation von E. coli……………………………………………………………….....6
3.1.1 Transformation…………………………………………………………………...6
3.1.2 Plasmidpräparation……………………………………………………………….6
3.1.3 Agarose Gelelektrophorese…………………………………………………….…6
3.1.4 Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung…………….….6
3.2 Biolistische Transformation………………………………………………………………6-7
3.2.1 Vorbereitung der Goldpartikel…………………………………………………....6
3.2.2 Beladen der Partikel mit Plasmid-DNA…………………………………………..6
3.2.3 Biolistische Transformation……………………………………………………...7
3.2.4 Fluoreszenzmikroskopie………………………………………………………….7
4. Ergebnisse…………………………………………………………………………………………..8-9
4.1 Transformation von E. coli – Analyse der Elutionsfraktion………………………………....8
4.1.1 Agarose Gelelektrophorese……………………………………………………….8
4.1.2 Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung………………...8
4.2 Biolistische Transformation………………………………………………………………...9
4.2.1 Fluoreszenzmikroskopie………………………………………………………….9
5. Diskussion………………………………………………………………………………………..10-13
5.1 Transformation von E. coli – Analyse der Elutionsfraktion……………………………10-11
5.1.1 Agarose Gelelektrophorese………………………………………………….…..10
5.1.2. Quantifizierung der DNA-Menge über fluorimetrische Messung…………..10-11
5.2 Biolistische Transformation……………………………………………………………….11
5.2.1 Fluoreszenzmikroskopie…………………………………………………….…..11
5.3 Eigene Meinung zur Gentechnik……………………………………………………….12-13
6. Literatur………………………………………………………………………………………….…..14
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, 1. Einleitung
Die Biolistische Transformation beschreibt die Aufnahme von ballistisch zugeführter Fremd-DNA
durch Zellen, ihr Name leitet sich vom englischen Ausdruck biological ballistic transformation ab. Sie
stellt eine einfache und schnelle Methode zur Erzeugung gentechnisch veränderter Zellen oder
Organismen dar, da die Methode ein breites Anwendungsspektrum hat lässt sie sich für eine Vielzahl
von Organismen einsetzen. Damit hat sie einen enormen Vorteil gegenüber der Transformation mit
Agrobacterium tumefaciens und der Protoplastentransformation, da diese nur bei einigen Arten
Anwendung finden.
Mit der Biolistischen Transformation wird Fremd-DNA in Zellen eingebracht und dort exprimiert, die
Transformation kann hierbei stabil oder transient erfolgen. Bei der stabilen Transformation wird die
Fremd-DNA in das Genom integriert, dadurch wird es an die Nachkommen weitergegeben und somit
dauerhaft im Genom fixiert. Dies kann sowohl im Kerngenom als auch im Mitochondrien- oder
Plastidgenom stattfinden. Die Fixierung im Mitochondriengenom ist überaus hilfreich, da die
Mitochondrien nur mütterlicherseits weitergegeben werden (Eva-Effekt) und somit eine unkontrollierte
Streuung der transformierten DNA verhindert werden kann. Die transiente Transformation ist zeitlich
begrenzt, da hier die DNA nicht in das Genom integriert wird geht der Effekt wieder verloren und
etabliert sich nicht unter den Nachkommen. Dies ist oft der Fall bei der Biolistischen Transformation,
aufgrund dessen eignet sie sich für Interaktionsstudien, Promotorstudien und zur Untersuchung
zellulärer Proteinlokalisation.
Um die Fremd-DNA einzubringen muss jedoch zuerst die pflanzliche Zellwand überwunden werden,
ohne dabei die Zelle letal zu beschädigen, daher greift das Funktionsprinzip der Biolistischen
Transformation auf eine spezifische Apparatur zurück die sogenannte Partikelkanone. Mit DNA
beschichtete sehr kleine Gold- oder Wolframpartikel (Mikrocarriers) werden auf einem Makrocarrier
befestigt, dieser wird in einer Vakuumkammer stark beschleunigt und dann abrupt abgebremst, die
Mikrocarriers lösen sich ab und werden mit enorm hohem Druck auf die Probe geschossen. So wird die
DNA in die Zelle eingebracht, ohne einen dauerhaften Schaden anzurichten (3).
Die Effizienz ist jedoch von einer Vielzahl von Faktoren abhängig und bei der Biolistischen
Transformation relativ gering. Um die Transformation und den Erfolg nachweisen zu können, werden
zusammen mit der Fremd-DNA Markergene miteingebracht. Diese Markergene sind entweder
Selektionsmarker, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz miteinbringen, damit lässt sich sofort eine
Selektion gegenüber untransformierten Zellen nachweisen, oder Reportergene, deren Genprodukte
leicht biochemisch, histochemisch, mikroskopisch oder photometrisch nachweisbar sind. Das
Reportergen wird meist mit einem zweiten Gen fusioniert oder an den Promotor angeheftet, es kann
dadurch Aufschluss über die Proteinlokalisation und -interaktion geben und lässt sich gut für
Promotorstudien einsetzen. (1)
Um die Fremd-DNA einzubringen werden Vektoren benötigt. Vektoren sind mobile Elemente, mit
deren Hilfe sich Fremd-DNA zwischen zwei Organismen übertragen lässt. Zu dieser Gruppe zählen die
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