Het onderzoek naar het
fluorescente eiwit van gen 4
Julie van Rijckevorsel (2786306) en Maxim Roos (2783389)
Bouwstenen van het Leven
Gezondheid en Leven
21-10-2022
Aantal woorden: 3668
, Abstract
Fluorescente eiwitten worden veel gebruikt in de wetenschap, ze dienen als marker en kunnen zo
bepaalde processen in cellen zichtbaar maken. In dit onderzoek is onderzocht voor welk
fluorescerend eiwit gen 4 op het plasmide in de gekregen bacteriën codeert en welke eigenschappen
het eiwit heeft. Om dit te kunnen achterhalen is er vanuit twee perspectieven onderzoek gedaan: op
DNA- en eiwitniveau. Er is eerst een DNA analyse gemaakt waarna het plasmide geïsoleerd werd en
vervolgens gedigesteerd. Nadat de gelelektroforese is uitgevoerd kunnen deze resultaten vergeleken
worden met een bandenpatroon om zo te achterhalen waar het DNA afkomstig van is. Met het
computerprogramma APE werd het bandenpatroon van het onderzochte DNA met een reeds
bekende bandenpatronen vergeleken. Dit bleek overeen te komen met het roodgekleurde
fluorescente eiwit: mCherry. Vervolgens zijn de overige plasmiden ingebouwd in de E.coli bacterie
stam, deze bacteriën zullen het fluorescerend eiwit aanmaken. Na lysatie, affiniteitschromatografie,
gelfiltratie, het bepalen van de eiwitconcentratie en als laatst door de SDS-page, kon er een
absorptie- en emissiespectrum gemaakt worden. Daarmee werd duidelijk dat het om mCherry ging
aangezien er een kenmerkende piek bij 585 nm waargenomen kon worden. Het emissiespectrum van
mCherry kwam ook overeen door de piek op 610nm. De rode kleur was ook duidelijk zichtbaar
wanneer de bacteriën onder UV-licht gehouden werden. Het fluorescerende eiwit van gen 4 was dus
mCherry.
, Inleiding
Shimomura ontdekte in 1961 een lichtgevende kwal, de Aequorea victoria. Na zo’n 10 000 kwallen
onderzocht te hebben ontdekte Shimomura met zijn team het eiwit aequorin, wat in de aanwezigheid
van Ca2+ blauw licht uitstraalde. Later ontdekte hij het eiwit ‘green protein’, wat daarna door Morin
and Hastings ‘green fluorescent protein’ genoemd is (1). Green fluorescent protein (GFP) piekte bij
een golflengte van 508 nm en aequorin piekte bij 470 nm. Het bleek dat aequorin eerst blauw licht
uitstraalde waarna GFP het blauwe licht om in groen licht (2). Tegenwoordig zijn green fluorescent
proteins onmisbaar in de biomedische en biotechnologische wereld. Deze eiwitten worden vaak
gebruikt om cellulaire structuren zichtbaar te maken. Sinds 1966 zijn er meerdere kleuren ontdekt;
blauw, geel en rood (3). Deze verschillende kleuren zijn ontstaan door verschil in structuur van het
chromofoor, het deeltje in het eiwit wat de fluorescentie weergeeft. Cyan Fluorescent Protein (CFP)
geeft een blauw/groene kleur af, Yellow Fluorescent Protein (YFP) een gele kleur en Red Fluorescent
Protein (mCherry) straalt een duidelijk rode kleur uit (2).
Fluorescente eiwitten zijn bovendien erg belangrijk geworden in de moleculaire biologie. Hier dienen
de eiwitten als een marker om andere eiwitten te kunnen bestuderen. Door middel van
fluorescentiemicroscopie is dan te achterhalen waar een eiwit zich precies in de cel bevindt. De
fluorescente eiwitten staan bekend om het feit dat ze erg accuraat en minimaal invasief zijn, ze
kunnen dus met zeer grote nauwkeurigheid markeren en richten weinig schade aan. Om deze reden
wordt de techniek tegenwoordig vaker gebruikt dan radioactieve labeling (4). In de
fluorescentiemicroscopie worden de fluorescente proteïnen op diverse manieren ingezet. Onder
andere bij fenotypering, een proces waarbij cellen van elkaar worden onderscheiden op basis van het
specifieke eiwit dat deze produceert. De fluorescerende eiwitten worden voornamelijk gebruikt om
cellen die microscopisch niet van elkaar te scheiden zijn toch in beeld te brengen. Vaak betreffen het
kanker- en immuuncellen, zo kan bijvoorbeeld bepaald worden met welk type kankercel een patiënt
te maken heeft, wat essentieel is om een passend behandelplan op te kunnen stellen (5).
In dit practicumverslag wordt onderzocht voor welk fluorescerend eiwit gen 4 op het plasmide in de
gekregen bacteriën codeert en wat de eigenschappen van dit eiwit zijn. In het practicum is vanuit
twee perspectieven onderzoek gedaan naar Fluorescente eiwitten, namelijk op DNA- en eiwitniveau.
Bij het onderzoek op DNA niveau is er gebruik gemaakt van de volgende technieken: plasmide
isolatie, restrictie digestie en agarose gel-elektroforese. Verder in het onderzoek is het eiwit
bestudeert om de voorspellingen die aan de hand van het onderzochte DNA waren gedaan te
controleren. In dit proces zijn eveneens verschillende technieken gebruikt, zoals: de
Bradford-methode, SDS-page, absorptiespectrometrie en het meten van de golflengte van het licht
dat het eiwit uitzendt door middel van een emissiespectrum.
fluorescente eiwit van gen 4
Julie van Rijckevorsel (2786306) en Maxim Roos (2783389)
Bouwstenen van het Leven
Gezondheid en Leven
21-10-2022
Aantal woorden: 3668
, Abstract
Fluorescente eiwitten worden veel gebruikt in de wetenschap, ze dienen als marker en kunnen zo
bepaalde processen in cellen zichtbaar maken. In dit onderzoek is onderzocht voor welk
fluorescerend eiwit gen 4 op het plasmide in de gekregen bacteriën codeert en welke eigenschappen
het eiwit heeft. Om dit te kunnen achterhalen is er vanuit twee perspectieven onderzoek gedaan: op
DNA- en eiwitniveau. Er is eerst een DNA analyse gemaakt waarna het plasmide geïsoleerd werd en
vervolgens gedigesteerd. Nadat de gelelektroforese is uitgevoerd kunnen deze resultaten vergeleken
worden met een bandenpatroon om zo te achterhalen waar het DNA afkomstig van is. Met het
computerprogramma APE werd het bandenpatroon van het onderzochte DNA met een reeds
bekende bandenpatronen vergeleken. Dit bleek overeen te komen met het roodgekleurde
fluorescente eiwit: mCherry. Vervolgens zijn de overige plasmiden ingebouwd in de E.coli bacterie
stam, deze bacteriën zullen het fluorescerend eiwit aanmaken. Na lysatie, affiniteitschromatografie,
gelfiltratie, het bepalen van de eiwitconcentratie en als laatst door de SDS-page, kon er een
absorptie- en emissiespectrum gemaakt worden. Daarmee werd duidelijk dat het om mCherry ging
aangezien er een kenmerkende piek bij 585 nm waargenomen kon worden. Het emissiespectrum van
mCherry kwam ook overeen door de piek op 610nm. De rode kleur was ook duidelijk zichtbaar
wanneer de bacteriën onder UV-licht gehouden werden. Het fluorescerende eiwit van gen 4 was dus
mCherry.
, Inleiding
Shimomura ontdekte in 1961 een lichtgevende kwal, de Aequorea victoria. Na zo’n 10 000 kwallen
onderzocht te hebben ontdekte Shimomura met zijn team het eiwit aequorin, wat in de aanwezigheid
van Ca2+ blauw licht uitstraalde. Later ontdekte hij het eiwit ‘green protein’, wat daarna door Morin
and Hastings ‘green fluorescent protein’ genoemd is (1). Green fluorescent protein (GFP) piekte bij
een golflengte van 508 nm en aequorin piekte bij 470 nm. Het bleek dat aequorin eerst blauw licht
uitstraalde waarna GFP het blauwe licht om in groen licht (2). Tegenwoordig zijn green fluorescent
proteins onmisbaar in de biomedische en biotechnologische wereld. Deze eiwitten worden vaak
gebruikt om cellulaire structuren zichtbaar te maken. Sinds 1966 zijn er meerdere kleuren ontdekt;
blauw, geel en rood (3). Deze verschillende kleuren zijn ontstaan door verschil in structuur van het
chromofoor, het deeltje in het eiwit wat de fluorescentie weergeeft. Cyan Fluorescent Protein (CFP)
geeft een blauw/groene kleur af, Yellow Fluorescent Protein (YFP) een gele kleur en Red Fluorescent
Protein (mCherry) straalt een duidelijk rode kleur uit (2).
Fluorescente eiwitten zijn bovendien erg belangrijk geworden in de moleculaire biologie. Hier dienen
de eiwitten als een marker om andere eiwitten te kunnen bestuderen. Door middel van
fluorescentiemicroscopie is dan te achterhalen waar een eiwit zich precies in de cel bevindt. De
fluorescente eiwitten staan bekend om het feit dat ze erg accuraat en minimaal invasief zijn, ze
kunnen dus met zeer grote nauwkeurigheid markeren en richten weinig schade aan. Om deze reden
wordt de techniek tegenwoordig vaker gebruikt dan radioactieve labeling (4). In de
fluorescentiemicroscopie worden de fluorescente proteïnen op diverse manieren ingezet. Onder
andere bij fenotypering, een proces waarbij cellen van elkaar worden onderscheiden op basis van het
specifieke eiwit dat deze produceert. De fluorescerende eiwitten worden voornamelijk gebruikt om
cellen die microscopisch niet van elkaar te scheiden zijn toch in beeld te brengen. Vaak betreffen het
kanker- en immuuncellen, zo kan bijvoorbeeld bepaald worden met welk type kankercel een patiënt
te maken heeft, wat essentieel is om een passend behandelplan op te kunnen stellen (5).
In dit practicumverslag wordt onderzocht voor welk fluorescerend eiwit gen 4 op het plasmide in de
gekregen bacteriën codeert en wat de eigenschappen van dit eiwit zijn. In het practicum is vanuit
twee perspectieven onderzoek gedaan naar Fluorescente eiwitten, namelijk op DNA- en eiwitniveau.
Bij het onderzoek op DNA niveau is er gebruik gemaakt van de volgende technieken: plasmide
isolatie, restrictie digestie en agarose gel-elektroforese. Verder in het onderzoek is het eiwit
bestudeert om de voorspellingen die aan de hand van het onderzochte DNA waren gedaan te
controleren. In dit proces zijn eveneens verschillende technieken gebruikt, zoals: de
Bradford-methode, SDS-page, absorptiespectrometrie en het meten van de golflengte van het licht
dat het eiwit uitzendt door middel van een emissiespectrum.
