Samenvatting Gentherapie, kanker en AIDS deeltentamen 1

Gentherapie, kanker en aids - hoorcolleges

HC en handouts 1/4

Transcriptie en translatie

Tot 1983 werd er gedacht dat er 3 klassen van sequenties waren in het DNA:
- promoters: hieraan binden RNA polymerase en TBP.
- enhancers
- silencers
In werkelijkheid zijn er 100en verschillende eiwitten die met transcriptie te maken hebben. Nu
weten we dat er ongeveer 1500 TF’s zijn.

TBP = TATA-box binding protein.
Je hebt een TATA-sequentie, hieraan bindt TBP. TBP zorgt ervoor dat DNA buigt waardoor
sequenties waar RNA pol aan moet binden beschikbaar worden.

Sp1 is een transcriptiefactor die bindt aan GC-box sequenties. Het bevat 2 domeinen, namelijk een
Zinc finger domein waarmee het aan DNA bindt. Het andere domein is rijk aan glutamine (Q), dit is
het trans-activatie domein. Dit houdt in dat Sp1 bindt aan DNA mbv Zinc finger kant en stuurt een
signaal naar de andere kant waar de cofactor aan geonden zit.
Sp1 is een activator, en is er dus om transcriptie te activeren/te laten toenemen (indien alle
activatoren gebonden zijn, zou transcriptie optimaal zijn). Het werkt daarnaast genspecifiek.
Een Sp1 zonder glutamine-rijk domein kan wel binden, maar stimuleert geen transcriptie. Het
transactivatie domein is dus weldegelijk essentieel voor het activeren van transcriptie.

Hiernaast is de ‘moderne’ versie van hoe
transcriptie werkt (aka wat er nu bekend is
vergeleken met de jaren ’80). Het pijltje
wijst naar HAT, aka histon acetyl
transferase. Dit kan acetyl groepen
modificeren op de histonen waardoor het
chromatine minder strak verpakt wordt en
het DNA beschikbaar komt voor
transcriptie.
Naast HAT zijn er nog meer modificerende
enzymen:
- HAT = histon acetyl transferase
- HDAC = histon deacetylase
- MTase = methyl transferase
- DNMT = DNA methyl transferase

Post-transcriptie heb je mRNA, deze wordt dan geprocessed.
Er wordt een cap op de 5’ kant gezet, een poly-A staart aan de
3’ kant en het mRNA wordt gespliced. Het mRNA bestaat dan
wel nog uit een deel UTR (untranslated region) aan beiden
kanten van het start en stop codon. Het deel wat wel een eiwit
wordt, heet het open reading frame.
Alternatieve translatie initiatie = Het blijkt dat de sequentie
rondom de ‘AUG’ allemaal de efficientie van eiwitsynthese
bepaalt, ipv dat alleen de AUG de translatie activator is. De
eerste AUG kan dus volgens dit principe genegeerd worden.

,Bij gentherapie gebruik je transcriptie/translatie als therapie. Bijvoorbeeld de triplex strategie of
anti-sense therapie.
- Triplex —> blokkeren van transcriptie in de kern
- Anti-sense therapie —> blokkeren van translatie in het cytoplasma

DNA-oligonucleotiden oftewel ‘oligo’s’ zijn stukjes van 16 tot 20
(gemodificeerde) nucleotiden. Een oligo bindt base afhankelijk met behulp
van hybridisatie. Het is in staat om een unieke plek in DNA te vinden en te
binden. Anti-sense oligo’s worden gebruikt in anti-sense therapie.

Oligo’s worden gemodificeerd voor meerdere redenen;
- Je wil het modificeren omdat ze erg gevoelig zijn voor afbraak door
DNAses of RNAses (machinerie wat vreemd DNA in het lichaam
afbreekt). Door de modificatie worden ze minder goed herkent.
- Daarnaast wil je een oligo modificeren om opname te verbeteren. Dat
doe je door de negatieve lading van een oligo te verminderen. 1
nucleotide heeft namelijk een negatieve lading van ongeveer -1, dat is in principe
niet heel veel maar als je dan 16-20 nucleotiden bij elkaar hebt kun je een
negatieve lading hebben van wel -20. Als een stofje heel erg negatief is wordt het
slecht opgenomen. Dus je kunt de negatieve lading verminderen door een atoom
te vervangen met een andere om opname te verbeteren.
Je kunt bij een fosfaatgroep een O vervangen met S (zwavel). Je kunt ook de O
vervangen met een methyl groep.

Ook kun je de suikerring modificeren, zoals bij een morpholino. Daar is de 5’ ring
vervangen door een 6’ ring. Ook is er een O vervangen door een N en is de base
veranderd. Dit heeft een aantal voordelen:
- Stabiliteit
- DNAse-resistent (door veranderde ring)
- Opname neemt toe (door aangepaste fosfaatgroep)
- Hydrofobiciteit

Normaal gesproken scant een ribosoom namelijk om te zoeken naar het
startcodon. Morpholino’s binden aan mRNA en belemmeren zo het scanning
proces van een ribosoom. Daarom moet een morpholino ook aan het 5’ UTR
(untranslated region) binden ipv in de reading frame. Als een ribosoom
namelijk al bezig is met transleren, kan het ribosoom een morpholino die
halfverwege zit er gewoon af gooien.

Een ander voorbeeld waar er
modificaties zijn gemaakt aan RNA,
is het corona vaccin. Daar is de
uracil verandert in het RNA om het
ongevoelig e maken voor afbraak
door DNAses.

In triplex therapie wordt er ook een
oligo gebruikt. Deze bindt aan DNA
om transcriptie te blokkeren. Alleen
was deze niet stabiel en werkte het
niet.

,P53 is een tumorsuppressor. Maar de mutant hiervan kan zich gedragen als proto-oncogen.

c-Myb is een belangrijk transcriptiefactor aka activator. Als je hier anti-sense dus tegen gebruikt, is
het dus ook waarschijnlijk heel dodelijk voor vele andere cellen.


Toetsvraag
Wat is het therapeutisch molecuul bij anti-sense therapie? Geef details omtrent dit
molecuul.
Oligo, mRNA of DNA molecuul die gemodificeerd is. Modificaties zoals O vd fosfaat vervangen
door een zwavel of de lading verminderen van de oligo. Modificaties zodat je zorgt dat het
molecuul efficient wordt opgenomen en niet wordt aangevallen door DNAses.
Een voorbeeld kan een morpholino zijn waar de 5’ ring is vervangen door een 6’ ring suiker en een
stikstof in de fosfaat groep.


Gentherapie
Gentherapie gebruikt genen, DNA en RNA sequenties, die vaak in een virus vector zijn geplaatst,
om symptomen van een ziekte te genezen of te voorkomen. Je induceert dus een verandering in
het fenotype door iets toe te voegen.
In andere woorden: de genetische correctie van een mutant phenotype.

Een voorbeeld waar dit gedaan is, is bij een patiënt met ADA-SCID, adenosine deaminase-severe
combined immunodeficiency. ADA zet normaal gesproken adenine om in inosine, waaruit andere
nucleotiden gemaakt kunnen worden. Bij ADA-SCID kan het dit niet meer doen. Het fenotype zie je
vooral in de T-cellen.
Een retrovirus met ADA is gebruikt om T-cellen te behandelen (buiten het lichaam). Het enzym
ADA was gekoppeld aan PEG om het te stabiliseren waardoor ADA langzaam werd afgegeven.
Vervolgens zijn de T-cellen weer teruggegeven aan de patiënt met behulp van een infuus. Hierdoor
had ze weer cellen die het WT gen konden synthetiseren.

, Virussen ‘misbruiken’ cellen als eiwit fabriek voor
virale eiwitten. Het dringt binnen een cel, insert
een stuk DNA in de gastheercel die vervolgens
dit DNA gaat synthetiseren. De virale eiwitten die
assembleren vervolgens tot virussen en dringen
uit de cel waardoor ze weer andere cellen
kunnen infecteren.
Bij gentherapie worden virussen gebruikt om de
gewenste genen bij zich te dragen. Ze inserten
het therapeutische gen in het virale DNA
waardoor het therapeutische gen ook wordt
gesynthetiseerd. Een deel van het virale DNA
moet worden weggehaald, omdat het virus zich
niet meer mag kunnen vermenigvuldigen. Een
paar essentiële genen zijn daarom ook
gemuteerd.



Welke virussen of vectoren zijn er?




1. Retrovirussen = hebben een lipide envelop. Integreren genen in de gastheer chromosomen
waardoor het lang stabiel blijft in de gastheer cel. Maar een nadeel is dat dit random gaat, dus
je kunt ook belangrijke genen belemerren. Maar deze kans is wel klein want maar 2% van al
het DNA zijn genen.
2. Adenovirussen = Een voordeel is dat het een groot therapeutisch gen kan dragen. Een nadeel
is dat het niet in het genoom integreert van de gastheer. Daarnaast zijn vele mensen al een
keer geïnfecteerd met een adenovirus dus kan het lichaam een afweer reactie geven.
3. Adeno-associated virussen = integreert genen in de gastheer chromosomen maar een nadeel
is dat het niet hele grote genen kan dragen. Maar een voordeel is dat het als een van de
weinige de hersenen in kan.
4. Liposomen = gepakt in een soort vetbolletje. Het corona vaccin maakt ook gebruik van
liposomen.
5. Naakt DNA = wordt slecht opgenomen.