Grundmodul Molekulare Zellbiologie • rRNA und nicht Proteine vermitteln Katalyse d. Bildung kovalenter
Peptidbdg.
I. Evolution & Visualisierung von Zellen • Proteine überwiegend strukturelle Rolle
• rRNA stark konserviert
Stammbaum des Lebens
RNA-Welt und die Ursprünge des Lebens
Hypothese d. RNA-Welt:
• RNA speicherte genetische
Informationen + Katalyse von ch.
Reaktionen
• DNA übernahm erst später Funktion
• Eubakterien: ähneln Eukaryoten in Gesamtstoffwechsel + als genetisches Material
Energieumwandlung, Lipiddoppelschichtmembran • Proteine wurden dann
• Achaebakterien: extromphil, ähneln Eukaryoten in ihrer Maschinerie Katalysatoren + Strukturelemente d.
zur Verarbeitung d. genetischen Informationen (Transkription, Zellen
Translation + Replikation), einzigartige Lipid-Monoschichten
• Welchen Vorteil bietet eine Membran, die aus einer Lipid-
Monoschicht aufgebaut ist?
à höhere Schmelztemperatur, dichtere Packung (höher Van-der- Merkmale von Prokaryoten & Eukaryoten
Waalskraft aufeinander), höhere Impermeabelität , verzweigte DNA frei im Cytoplasma DNA im Kernkompartiment
Kohlenstoffketten (Impermeabelität) Kompaktes Genom Umfangreiches Genom
(codierende + nicht codierende
Das Ribosom DNA)
• Die ribosomale RNA erfüllt eine sehr wichtige Funktion. Feste Zellwand Mit oder ohne Zellwand
Welche? Kein Cytoskelett Cytoskelett
à Teil d. Ribosoms Einzeller Einzeller (Protisten) + Vielzeller
• Decodiert mRNA Große biochemische Geringere Anpassungsfähigkeit
• Bildet Peptidbindungen Anpassungsfähigkeit
• Große + kleine UE: 30S (16S RNA, 21 Proteine (S1-S21) + 50S à Stoffwechsel abhängig von
(23S RNA, 34 Proteine (L1-L34)k Oxidation organischer Moleküle durch
Mitochondrien
Organotrophe: nutzen praktisch jedes organisches Molekül als
Nahrungsmittel, wie z.B. Zucker, AS, Kohlenwasserstoffe, Methan
• Ribosom= Ribozym Phototrophe: nutzen Licht als Energiequelle, erzeugen manchmal
Sauerstoff als Nebenprodukt
1
,Lithotrophe: verwenden anorganische Nährstoffe („Felse“), nutzen Anaerobe gegen aerobe Oxidation von Glucose
Kohlenstoff aus CO2 + H2S oder Fe2+ um ihren Energiebedarf zu decken • Glykolyse
• Kein Bedarf an O2
Einzellige Eukaryoten: Protisten • Ergibt 2ATP pro Glucosemolekül
• Jäger (z.B. Amoeben)
• Photosynthetisierende (z.B. Algen) Beweise für Endosymbiontentheorie
• Abfallverwerter (z.B. Hefe) • MT + CHLP enthalten ringförmige Prokaryoten-DNA
• MT nutzen abweichenden genetischen Code
Evolution der Eukaryotenzelle • Enthalten Bakterienchromosomen (30S&50S UE statt
• Unterteilung in mehrere geschlossene Kompartimentsysteme eukaryotischen 40S&60S UE)
• Umformung der Verbindung d. DNA (Prokaryotenzelle) mit PM zu • Selbstständige Vermehrung
umschlossenen Kernporenkomplex • Äußere Membran entspricht Zellmembran, innere Membran einer
Bakterienmembran (reich an Phosphatidgylcerin + Cardiolipin)
Hybridgenome der Eukaryotenzellen
• MT + CHLP enthalten jeweils ein kompaktes Genom, unterscheidet
sich von Kern-DNA
• MT+CHLP-DNA sind degenerierte Versionen d. entsprechenden
Bakteriengenome
• Mitochondriale Gene werden über einen nicht-Mendelschen
• Mechanismus vererbt. Warum?
• Einschnürungen d. PM als Ausgangsschritt zur Entstehung à Eizelle steuert immer mehr Cytoplasma an Zygote bei, als d.
einzelner Kompartimente mit teils gesonderter Membran Spermium. MtDNA wird immer maternal vererbt
• Keine Korrelation zwischen Genomgröße + Anzahl von Genen
Endosymbiontentheorie
Humangenom
• Anaerobe Ur-Eukaryontenzelle hat aerobe Prokaryotenzelle
• Enthält weniger als 20.000 Gene
(Eubakterium) aufgenommen
• Max. 1,4% d. Sequenz kodiert für Proteine (=5% d. 28% d.
• Haben von Eucyte herrührende Membran
Sequenz als RNA transkribiert)
• In aeroben Eukaryotenzelle Mitochondrien mit Doppelmembran
• >70% ist „Junk“DNA, die Organismus wenig bzw. keinen selektiven
• Welche Vorteile bietet diese Partnerschaft für die
Vorteil verschafft (nur 11% Junk-DNA in E.coli)
Gastgeber(zelle)?
• „Junk“DNA: meist repetitive Sequenzen von „parasitärem“ DNA-
à erzeugen energiereiche Phosphate in Form von ATP
Ursprung
• Frühe Eukaryotenzelle (mit Mitochondrien) „verschlang“
photosynthetisches Bakterium (àChloroplasten mit
Modellsysteme für eukaryotische Zellbiologie
Doppelmembran)
• Bakterien + Bakteriophagen: Gründungsmodell d. Molekularbiologie
• Zellen mit Chloroplasten mussten keine anderen Zellen mehr jagen
• Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe: Minimalmodell Eukaryot
• Pflanzenzellen haben so Fähigkeit zur Phagocytose verloren +
• Aradopsis thaliana: von 300.000 Spezies als Modellpflanze
feste, schützende Zellwand gebildet
gewählt
2
, • Drosophila melanogaster + Caenorhabditis elegans: Hauptmodell • Maximale Auflösung: von 400nm (violettes Licht) bis 700nm
für Tierentwicklung (dunkelrotes Licht)
• Mus musculus: Hauptmodell für Säugetierentwicklung & Krankheit à Mitochondrien + Bakterien kleinste sichtbaren Objekte
Dimensionen biologischer Objekte „Hellfeld“-Mikroskopie
• Licht durch Kondensorlinsen auf Probe fokussiert
• Objektivlinsen + Okullar (Projektionslinsen) so eingestellt, dass Bild
d. beleuchteten Objekts abgebildet wird
• Auslösungsgrenze abhängig von Wellenlänge d. Lichts + Blende d.
Linsensystems (max. 0,2µm)
• Einfärben d. Probe mit organischen Farbstoffen: farbiges Bild
Differenzial-Interferenzkontrastmikroskop
• Betrachtung von lebenden Zellen (z.B. Mitose)
Floureszenzmikroskopie
• Licht passiert zwei Filtersätze
• 1.Filter (F1): filtert Licht vor Erreichen d. Objektes
• 2.Filter (F2): filtert vom Objekt zurückkommendes Licht
• F1 können nur gewisse Wellenlängen passieren, die
Floureszenzfarbstoffe anregen
• F2 blendet dieses Licht aus, nur von floureszierenden Farbstoffen
imitierte Wellenlängen durchtreten lässt
• Dichrotischer Spiegel: strahlenteilender Spiegel, spiegelt Licht
unterhalb einer bestimmten Wellenlänge + überträgt Licht oberhalb
d. Wellenlänge
Visualisierung von Zellen • Kopplung von floureszierenden Farbstoffen an Antikörpermoleküle,
• Hellfeldmikroskopie binden an gewisse Makromoleküle, erkennbar in Zellen
• Phasenkontrastmikroskopie
Floureszierende Proteine als Reporter in lebenden Zellen
• Differenzial-Interferenzkontrastmikroskopie
• GFB Protein oder Aktin zur Markierung
• Konventionelle FM (Floureszensmikroskopie)
• Aufenthaltsort + Verhalten erkennbar
• Konfokale Laser Scanning FM
• PALM, TIRF, SDM, usw.
Konfokale FM
• Grundsätzliche Beschränkung für Auflösung aller Mikroskope: • Scharfes Bild (anders als bei Koventioneller FM)
Strahlung von bestimmter Wellenlänge kann keine
• Erzeugt optische Schnitte vom nicht fokussierten Licht
Strukturunterschiede auflösen, die (viel) kleiner sind, als die
Wellenlänge • Mit Optik eines Flouresszenzmikroskops ausgerüstet
• Äußerste Grenze à abhängig von Wellenlänge d. biegbaren Lichts • Fokussiert zu jedem Zeitpunkt nur einem Lichtfleck
• Sehr helles Licht erforderlich, Laser
3
, • Abtasten d. Objektes durch Laser erzeugt scharfes Bild • Abdruck gewaschen + auf Kupfernetz gebracht: räumlicher
• Strukturaufklärung von komplizierten biologischen Objekten Eindruck
• Was ist der Ursprung dieser Partikelstruktur?
Transmissionselektronenmikroskop (TEM) à Proteine, die Membran durchqueren (Transmembranproteine)
• Wellenlänge eines Elektrons verringert, wenn seine
Geschwindigkeit erhöht Rasterelektronenmikroskopie
• Hochspannung kombiniert mit magnetischen Linsen ermöglicht eine • Direkt von räumlicher Struktur d. Oberfläche eines Objekts
Auflösung von bis zu 0,1nm • Fixierung, Trocknung + mit dünnen Metallfilm beschattet
• Nutzt Elektronenstrahl • Von Elektronenstrahl abgetastet
• Statt Glaslinsen Magnetspulen • Von Oberfläche imitierten Elektronen durch Detektor gemessen
• Probe in Vakuum • Strak vergrößertes Abbild d. Oberfläche
• Elektronendichte Schwermetalle absorbierten Elektronen
(Entfernen bei Durchtritt der Probe) Markierung von Biomolekülen mit Radioisotopen möglich, um Schicksal zu
verfolgen.
Herstellung der biologischen Probe für TEM-Analyse
• Objekt wird ch. durch Glutaralaldehyd + Osmium Tetroxide fixiert:
kovalente Vernetzung von Protein-+ Lipidmolekülen
• Extrem dünn geschnitten
• Entwässerung + von Kunstharz imprägniert
• Auf Kupfernetz gelegt
• Mit Salzen von schweren Metallen imprägniert
Immunoelektronenmikroskopie (IEM)
Negative Färbung ermöglicht die Visualisierung von Biomolekülen
• Auf dünnen Kohlenstofffilm wird ein Tropfen mit Mischung aus
Biomolekülen mit Schwermetalllösung getropft + getrocknet
• Sehr dünne Schicht d. Metallsalzes bedeckt Kohlenstofffilm, außer
auf Stellen wo absorbiertes Makromolekül war
• Umgekehrtes Bild
Gefrierbruchtechnik
• Biologisches Objekt ultraschnell tiefgefroren à flüssiges Propan
• Mit Messer aufgebrochen
• Bruchebenen oft durch Mitte einer Membrandoppelschicht
• Objekt wird beschattet mit Schwermetallatomen
• Verstärkungsschicht von Kohlenstoff wird aufgedampft
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Peptidbdg.
I. Evolution & Visualisierung von Zellen • Proteine überwiegend strukturelle Rolle
• rRNA stark konserviert
Stammbaum des Lebens
RNA-Welt und die Ursprünge des Lebens
Hypothese d. RNA-Welt:
• RNA speicherte genetische
Informationen + Katalyse von ch.
Reaktionen
• DNA übernahm erst später Funktion
• Eubakterien: ähneln Eukaryoten in Gesamtstoffwechsel + als genetisches Material
Energieumwandlung, Lipiddoppelschichtmembran • Proteine wurden dann
• Achaebakterien: extromphil, ähneln Eukaryoten in ihrer Maschinerie Katalysatoren + Strukturelemente d.
zur Verarbeitung d. genetischen Informationen (Transkription, Zellen
Translation + Replikation), einzigartige Lipid-Monoschichten
• Welchen Vorteil bietet eine Membran, die aus einer Lipid-
Monoschicht aufgebaut ist?
à höhere Schmelztemperatur, dichtere Packung (höher Van-der- Merkmale von Prokaryoten & Eukaryoten
Waalskraft aufeinander), höhere Impermeabelität , verzweigte DNA frei im Cytoplasma DNA im Kernkompartiment
Kohlenstoffketten (Impermeabelität) Kompaktes Genom Umfangreiches Genom
(codierende + nicht codierende
Das Ribosom DNA)
• Die ribosomale RNA erfüllt eine sehr wichtige Funktion. Feste Zellwand Mit oder ohne Zellwand
Welche? Kein Cytoskelett Cytoskelett
à Teil d. Ribosoms Einzeller Einzeller (Protisten) + Vielzeller
• Decodiert mRNA Große biochemische Geringere Anpassungsfähigkeit
• Bildet Peptidbindungen Anpassungsfähigkeit
• Große + kleine UE: 30S (16S RNA, 21 Proteine (S1-S21) + 50S à Stoffwechsel abhängig von
(23S RNA, 34 Proteine (L1-L34)k Oxidation organischer Moleküle durch
Mitochondrien
Organotrophe: nutzen praktisch jedes organisches Molekül als
Nahrungsmittel, wie z.B. Zucker, AS, Kohlenwasserstoffe, Methan
• Ribosom= Ribozym Phototrophe: nutzen Licht als Energiequelle, erzeugen manchmal
Sauerstoff als Nebenprodukt
1
,Lithotrophe: verwenden anorganische Nährstoffe („Felse“), nutzen Anaerobe gegen aerobe Oxidation von Glucose
Kohlenstoff aus CO2 + H2S oder Fe2+ um ihren Energiebedarf zu decken • Glykolyse
• Kein Bedarf an O2
Einzellige Eukaryoten: Protisten • Ergibt 2ATP pro Glucosemolekül
• Jäger (z.B. Amoeben)
• Photosynthetisierende (z.B. Algen) Beweise für Endosymbiontentheorie
• Abfallverwerter (z.B. Hefe) • MT + CHLP enthalten ringförmige Prokaryoten-DNA
• MT nutzen abweichenden genetischen Code
Evolution der Eukaryotenzelle • Enthalten Bakterienchromosomen (30S&50S UE statt
• Unterteilung in mehrere geschlossene Kompartimentsysteme eukaryotischen 40S&60S UE)
• Umformung der Verbindung d. DNA (Prokaryotenzelle) mit PM zu • Selbstständige Vermehrung
umschlossenen Kernporenkomplex • Äußere Membran entspricht Zellmembran, innere Membran einer
Bakterienmembran (reich an Phosphatidgylcerin + Cardiolipin)
Hybridgenome der Eukaryotenzellen
• MT + CHLP enthalten jeweils ein kompaktes Genom, unterscheidet
sich von Kern-DNA
• MT+CHLP-DNA sind degenerierte Versionen d. entsprechenden
Bakteriengenome
• Mitochondriale Gene werden über einen nicht-Mendelschen
• Mechanismus vererbt. Warum?
• Einschnürungen d. PM als Ausgangsschritt zur Entstehung à Eizelle steuert immer mehr Cytoplasma an Zygote bei, als d.
einzelner Kompartimente mit teils gesonderter Membran Spermium. MtDNA wird immer maternal vererbt
• Keine Korrelation zwischen Genomgröße + Anzahl von Genen
Endosymbiontentheorie
Humangenom
• Anaerobe Ur-Eukaryontenzelle hat aerobe Prokaryotenzelle
• Enthält weniger als 20.000 Gene
(Eubakterium) aufgenommen
• Max. 1,4% d. Sequenz kodiert für Proteine (=5% d. 28% d.
• Haben von Eucyte herrührende Membran
Sequenz als RNA transkribiert)
• In aeroben Eukaryotenzelle Mitochondrien mit Doppelmembran
• >70% ist „Junk“DNA, die Organismus wenig bzw. keinen selektiven
• Welche Vorteile bietet diese Partnerschaft für die
Vorteil verschafft (nur 11% Junk-DNA in E.coli)
Gastgeber(zelle)?
• „Junk“DNA: meist repetitive Sequenzen von „parasitärem“ DNA-
à erzeugen energiereiche Phosphate in Form von ATP
Ursprung
• Frühe Eukaryotenzelle (mit Mitochondrien) „verschlang“
photosynthetisches Bakterium (àChloroplasten mit
Modellsysteme für eukaryotische Zellbiologie
Doppelmembran)
• Bakterien + Bakteriophagen: Gründungsmodell d. Molekularbiologie
• Zellen mit Chloroplasten mussten keine anderen Zellen mehr jagen
• Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe: Minimalmodell Eukaryot
• Pflanzenzellen haben so Fähigkeit zur Phagocytose verloren +
• Aradopsis thaliana: von 300.000 Spezies als Modellpflanze
feste, schützende Zellwand gebildet
gewählt
2
, • Drosophila melanogaster + Caenorhabditis elegans: Hauptmodell • Maximale Auflösung: von 400nm (violettes Licht) bis 700nm
für Tierentwicklung (dunkelrotes Licht)
• Mus musculus: Hauptmodell für Säugetierentwicklung & Krankheit à Mitochondrien + Bakterien kleinste sichtbaren Objekte
Dimensionen biologischer Objekte „Hellfeld“-Mikroskopie
• Licht durch Kondensorlinsen auf Probe fokussiert
• Objektivlinsen + Okullar (Projektionslinsen) so eingestellt, dass Bild
d. beleuchteten Objekts abgebildet wird
• Auslösungsgrenze abhängig von Wellenlänge d. Lichts + Blende d.
Linsensystems (max. 0,2µm)
• Einfärben d. Probe mit organischen Farbstoffen: farbiges Bild
Differenzial-Interferenzkontrastmikroskop
• Betrachtung von lebenden Zellen (z.B. Mitose)
Floureszenzmikroskopie
• Licht passiert zwei Filtersätze
• 1.Filter (F1): filtert Licht vor Erreichen d. Objektes
• 2.Filter (F2): filtert vom Objekt zurückkommendes Licht
• F1 können nur gewisse Wellenlängen passieren, die
Floureszenzfarbstoffe anregen
• F2 blendet dieses Licht aus, nur von floureszierenden Farbstoffen
imitierte Wellenlängen durchtreten lässt
• Dichrotischer Spiegel: strahlenteilender Spiegel, spiegelt Licht
unterhalb einer bestimmten Wellenlänge + überträgt Licht oberhalb
d. Wellenlänge
Visualisierung von Zellen • Kopplung von floureszierenden Farbstoffen an Antikörpermoleküle,
• Hellfeldmikroskopie binden an gewisse Makromoleküle, erkennbar in Zellen
• Phasenkontrastmikroskopie
Floureszierende Proteine als Reporter in lebenden Zellen
• Differenzial-Interferenzkontrastmikroskopie
• GFB Protein oder Aktin zur Markierung
• Konventionelle FM (Floureszensmikroskopie)
• Aufenthaltsort + Verhalten erkennbar
• Konfokale Laser Scanning FM
• PALM, TIRF, SDM, usw.
Konfokale FM
• Grundsätzliche Beschränkung für Auflösung aller Mikroskope: • Scharfes Bild (anders als bei Koventioneller FM)
Strahlung von bestimmter Wellenlänge kann keine
• Erzeugt optische Schnitte vom nicht fokussierten Licht
Strukturunterschiede auflösen, die (viel) kleiner sind, als die
Wellenlänge • Mit Optik eines Flouresszenzmikroskops ausgerüstet
• Äußerste Grenze à abhängig von Wellenlänge d. biegbaren Lichts • Fokussiert zu jedem Zeitpunkt nur einem Lichtfleck
• Sehr helles Licht erforderlich, Laser
3
, • Abtasten d. Objektes durch Laser erzeugt scharfes Bild • Abdruck gewaschen + auf Kupfernetz gebracht: räumlicher
• Strukturaufklärung von komplizierten biologischen Objekten Eindruck
• Was ist der Ursprung dieser Partikelstruktur?
Transmissionselektronenmikroskop (TEM) à Proteine, die Membran durchqueren (Transmembranproteine)
• Wellenlänge eines Elektrons verringert, wenn seine
Geschwindigkeit erhöht Rasterelektronenmikroskopie
• Hochspannung kombiniert mit magnetischen Linsen ermöglicht eine • Direkt von räumlicher Struktur d. Oberfläche eines Objekts
Auflösung von bis zu 0,1nm • Fixierung, Trocknung + mit dünnen Metallfilm beschattet
• Nutzt Elektronenstrahl • Von Elektronenstrahl abgetastet
• Statt Glaslinsen Magnetspulen • Von Oberfläche imitierten Elektronen durch Detektor gemessen
• Probe in Vakuum • Strak vergrößertes Abbild d. Oberfläche
• Elektronendichte Schwermetalle absorbierten Elektronen
(Entfernen bei Durchtritt der Probe) Markierung von Biomolekülen mit Radioisotopen möglich, um Schicksal zu
verfolgen.
Herstellung der biologischen Probe für TEM-Analyse
• Objekt wird ch. durch Glutaralaldehyd + Osmium Tetroxide fixiert:
kovalente Vernetzung von Protein-+ Lipidmolekülen
• Extrem dünn geschnitten
• Entwässerung + von Kunstharz imprägniert
• Auf Kupfernetz gelegt
• Mit Salzen von schweren Metallen imprägniert
Immunoelektronenmikroskopie (IEM)
Negative Färbung ermöglicht die Visualisierung von Biomolekülen
• Auf dünnen Kohlenstofffilm wird ein Tropfen mit Mischung aus
Biomolekülen mit Schwermetalllösung getropft + getrocknet
• Sehr dünne Schicht d. Metallsalzes bedeckt Kohlenstofffilm, außer
auf Stellen wo absorbiertes Makromolekül war
• Umgekehrtes Bild
Gefrierbruchtechnik
• Biologisches Objekt ultraschnell tiefgefroren à flüssiges Propan
• Mit Messer aufgebrochen
• Bruchebenen oft durch Mitte einer Membrandoppelschicht
• Objekt wird beschattet mit Schwermetallatomen
• Verstärkungsschicht von Kohlenstoff wird aufgedampft
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