Methoden: overzicht
2.2 Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Definities:
- Precisie = variabiliteit =
o maat voor de reproduceerbaarheid (=> standaard deviatie, coëfficiënt van variatie)
- Accuraatheid =
o verschil tussen gemeten waarde en de ‘echte’ waarde => populatiestatistiek
(confidentieniveau / confidentie-interval)
- Detectielimiet = gevoeligheid =
o kleinste waarde die gemeten kan worden
- Kwantificatielimiet =
o kleinste waarde die voldoende nauwkeurig kan gemeten worden
- Analytische range / dynamic range =
o gebied dat reproduceerbare gegevens geeft
- Analytische specificiteit = selectiviteit =
o mate waardoor andere componenten in het systeem interfereren
- Analytische sensitiviteit =
o maat van verandering in output tov. de verandering in input
- Robuustheid =
o mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine verschillen in
experimentele parameters (bv. pH)
Selectie van de methode
,2.3. RNA
2.3.1 Voorzorgen staalname
Mogelijke problemen:
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAsen
o Bv. RNase H
- DNA contaminatie
Staalname:
- Anticoagulans => EDTA
o Heparine NIET door inhibitie DNA/RNA-interacties
- RNA stabilisatie
o Temperatuur => onmiddellijk verwerken van staal of invriezen in vloeibare stikstof
o Totaal bloed => vacuümtube met RNA bewaarmiddel
▪ PAXgene tube
o Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel
▪ RNAlater
▪ Trizol
Staalverwerking:
- Steriel!
- Nuclease (bv. RNasen) vrije producten => alles eraan doen om RNA niet te laten afbreken
- RNase inhibitoren
o DEPC (werkt niet in TRIS-buffer, en carcinogeen)
Bewaring:
- RNase-vrij water
- -80°C (=> pfizer)
- Alcoholprecipitaat
DNA contaminatie:
- Detecteren
o RTmin controle
o Elektroforese
- Verwijderen: DNase behandeling
o DNase toevoegen
o Inactivatie (hitte) of verwijdering DNase na behandeling
o Nadeel: verlies of degradatie RNA mogelijk.
,2.3.2 RNA extractie
1. Lysis
= weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen,
goede homogenisatie belangrijk.
Detergenten: ➔ VOORKEURSMETHODE
- SDS, Trizol (=guanidium thiocyanaat), etc.
Vriezen & ontdooien:
Mechanische homogenisatie: Vaak te brut voor RNA
- Pletten in vloeibare stikstof => mortier en pestel
- Bead-gebaseerde homogenisator
Vloeibare homogenisatie:
- Dounce homogenisator => oplossing tussen glazen pestels
- Voordeel: mild, laat celfracties (organellen) intact!
Sonicatie:
- Nadeel: fragmenteerd ook DNA & RNA
Vaak toevoeging van inhibitoren voor bv. RNasen.
2. Isoleren
RNA extractive met organsiche solventen
- Trizol (= guanidium thiocyanaat) – fenol - chloroform
- Guanidium thiocyanaat = cel lysis + RNase inhibitor
- Toevoegen, goed Mengen, RNA (in waterlaag) ne gescheiden van DNA en eiwitten (in
organische laag + inter-fase = tussen 2 lagen)
- ‘in huis’ – protocol
Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid.
Door verschil in pH tussen DNA (7) en RNA(4-5) kunnen we RNA scheiden van DNA => let op moeilijk
voor volledige scheiding.
, Alcoholprecipitatie
Alcohol + zout precipiteert DNA + RNA
Fosfaat groep in DNA & RNA negatief geladen:hydrofiel ➔ wordt geneutraliseerd door positieve
lading en wordt Hydrofoob ➔ slaan neer!
Kolomchromatografie
Principe:
- Bepaalde condities van zout + pH => selectieve binding van RNA (DNA meestal niet 100%
verwijderd)
- Andere condities zetten RNA weer vrij => elutie
Eenvoudig
Zeer goede zuiverheid
€
Beperkte opbrengst door capaciteit kolommen
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magnetische beads uit oplossing halen
bv. covid-19 diagnostische tests
Silica kolom
o Buffer met chaotrope zouten (bv. guanidium chloride):
▪ Lysis
▪ Nuclease inhibitie
▪ Chaotroop zout zorgt voor de selectieve binding van RNA aan silica kolom
o ‘spin’ kolom: vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
o Elutie (= ‘losmaken’)
▪ Water/buffer zet RNA terug vrij
2.2 Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Definities:
- Precisie = variabiliteit =
o maat voor de reproduceerbaarheid (=> standaard deviatie, coëfficiënt van variatie)
- Accuraatheid =
o verschil tussen gemeten waarde en de ‘echte’ waarde => populatiestatistiek
(confidentieniveau / confidentie-interval)
- Detectielimiet = gevoeligheid =
o kleinste waarde die gemeten kan worden
- Kwantificatielimiet =
o kleinste waarde die voldoende nauwkeurig kan gemeten worden
- Analytische range / dynamic range =
o gebied dat reproduceerbare gegevens geeft
- Analytische specificiteit = selectiviteit =
o mate waardoor andere componenten in het systeem interfereren
- Analytische sensitiviteit =
o maat van verandering in output tov. de verandering in input
- Robuustheid =
o mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine verschillen in
experimentele parameters (bv. pH)
Selectie van de methode
,2.3. RNA
2.3.1 Voorzorgen staalname
Mogelijke problemen:
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAsen
o Bv. RNase H
- DNA contaminatie
Staalname:
- Anticoagulans => EDTA
o Heparine NIET door inhibitie DNA/RNA-interacties
- RNA stabilisatie
o Temperatuur => onmiddellijk verwerken van staal of invriezen in vloeibare stikstof
o Totaal bloed => vacuümtube met RNA bewaarmiddel
▪ PAXgene tube
o Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel
▪ RNAlater
▪ Trizol
Staalverwerking:
- Steriel!
- Nuclease (bv. RNasen) vrije producten => alles eraan doen om RNA niet te laten afbreken
- RNase inhibitoren
o DEPC (werkt niet in TRIS-buffer, en carcinogeen)
Bewaring:
- RNase-vrij water
- -80°C (=> pfizer)
- Alcoholprecipitaat
DNA contaminatie:
- Detecteren
o RTmin controle
o Elektroforese
- Verwijderen: DNase behandeling
o DNase toevoegen
o Inactivatie (hitte) of verwijdering DNase na behandeling
o Nadeel: verlies of degradatie RNA mogelijk.
,2.3.2 RNA extractie
1. Lysis
= weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen,
goede homogenisatie belangrijk.
Detergenten: ➔ VOORKEURSMETHODE
- SDS, Trizol (=guanidium thiocyanaat), etc.
Vriezen & ontdooien:
Mechanische homogenisatie: Vaak te brut voor RNA
- Pletten in vloeibare stikstof => mortier en pestel
- Bead-gebaseerde homogenisator
Vloeibare homogenisatie:
- Dounce homogenisator => oplossing tussen glazen pestels
- Voordeel: mild, laat celfracties (organellen) intact!
Sonicatie:
- Nadeel: fragmenteerd ook DNA & RNA
Vaak toevoeging van inhibitoren voor bv. RNasen.
2. Isoleren
RNA extractive met organsiche solventen
- Trizol (= guanidium thiocyanaat) – fenol - chloroform
- Guanidium thiocyanaat = cel lysis + RNase inhibitor
- Toevoegen, goed Mengen, RNA (in waterlaag) ne gescheiden van DNA en eiwitten (in
organische laag + inter-fase = tussen 2 lagen)
- ‘in huis’ – protocol
Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid.
Door verschil in pH tussen DNA (7) en RNA(4-5) kunnen we RNA scheiden van DNA => let op moeilijk
voor volledige scheiding.
, Alcoholprecipitatie
Alcohol + zout precipiteert DNA + RNA
Fosfaat groep in DNA & RNA negatief geladen:hydrofiel ➔ wordt geneutraliseerd door positieve
lading en wordt Hydrofoob ➔ slaan neer!
Kolomchromatografie
Principe:
- Bepaalde condities van zout + pH => selectieve binding van RNA (DNA meestal niet 100%
verwijderd)
- Andere condities zetten RNA weer vrij => elutie
Eenvoudig
Zeer goede zuiverheid
€
Beperkte opbrengst door capaciteit kolommen
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magnetische beads uit oplossing halen
bv. covid-19 diagnostische tests
Silica kolom
o Buffer met chaotrope zouten (bv. guanidium chloride):
▪ Lysis
▪ Nuclease inhibitie
▪ Chaotroop zout zorgt voor de selectieve binding van RNA aan silica kolom
o ‘spin’ kolom: vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
o Elutie (= ‘losmaken’)
▪ Water/buffer zet RNA terug vrij
