Volledige samenvatting Methoden in het biomedisch onderzoek (3)

Methoden 3
HS 2: DNA
DNA > basen (adenine, guanine, cytosine, thymine)
= drager geneAsch materiaal

1. DNA sequenAebepaling
Evolu&e in methoden
- First generaAon sequencing
o Sanger, cloneren, elektroforese
o = “Gouden standaard” voor KLEINE projecten
- Second generaAon sequencing
o ‘Next-generaAon sequencing’ of ‘short-read NGS’
o Massief parallel sequencen van clonaal in vitro geamplificeerde moleculen
o Vb: Illumina
- Third generaAon sequencing
o ‘next-next generaAon sequencing’ of ‘long-read NGS’
o Sequencing van individuele DNA moleculen (geen amplificaAe)
o Vb Nanopore
- !!! evoluAe in capaciteit, snelheid en kosten (duurder)

Toepassingen
De novo genoom sequenAebepalingen
- Ongekende genomen (dus nog geen sequence van gemaakt)
- Vb Humaan Genoom project
- Nieuwe organismen (bv Sars-CoV-2)
- Gedeeltelijk of volledig

Resequencing
- ReferenAegenoom bestaat à individuen sequencen tov referenAegenoom
- Gebruik:
o SNPs (verschillen tsn individuen)
o MutaAes
o Construct verificaAe
o Klinische toepassingen: diagnose, farmacogeneAca, NIP-test

SequenAebepaling als teller
- SequenAebepaling om transcript te idenAficeren
- Aantallen DNA (of RNA) moleculen
- Hoe vaak kom je zelfde transcript tegen = tellen
- Vb RNAseq




1

, De novo (referenAe genoom) Resequencing (individueel)
Start = genomisch DNA Start = genomisch DNA
- Grote fragmenten - Kleine fragmenten
- Insereer in clones - Maak miljoenen sequenAe reads
- Orden clones - Alligneer reads naast referenAe
- Breek clones in kleinere stukjes genoom
- Maak duizende sequence reads - IdenAficeer verschillen tsn individu
- Assembleer sequenAe van clone en referenAegenoom
- Assembleer sequenAe van
overlappende clones
Resultaat = referenAe genoom
Zie tekening in PPT


Whole genome, exome en targeted sequencing
- WGS (whole genome sequencing)
- WES (whole exon sequencing)
o = Coderende sequenAe
o = 1,5% van genoom
- Targeted sequencing
o = Specifieke regio sequencen (bv X-chr)
- Transcriptoom: RNA -> cDNA
o Daarna methodes voor DNA toepassen

1ST GENERATION SEQUENTIEBEPALING (2 methoden: Maxam & Gilber / Sanger)
Maxam & Gilbert = chemische klieving methode (niet acAef kennen)
- DifferenAële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacAes,
gevolgd door scheiding volgens grooke op gel en visualisaAe via autoradiografie
- Nadeel: relaAef korte fragmenten, niet helemaal specifiek à sequenAe niet alAjd
éénduidig

Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminaAe
- Template/matrijs = clone of PCR amplicon
o = “gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd w door cloneren of specifiek
fragment dat geamplificeerd w met PCR”
o Vb van een gDNA fragment
- Polymerase + primer + mengsel van 4dNTPs + ddNTPs (# fluorescente label)
o Polymerase = thermostabiel & inbouw (d)dNTPs zonder onderscheid
o dNTPs: geen 2’ OH
o ddNTPs: geen 2’ en 3’ OH (-> dus geen PDE-bindingen in DNA keten)
o !!! juiste verhouding aanwezig: nl overmaat dNTPs (anders zouden ketens op
zelfde plek stoppen)
ð Inbouw dNTP: reacAe loopt door
ð Inbouw ddNTP: reacAe stopt


2

,- Scheiding strengen op gel of capillair à elektroforegram
o Capillaire elektroforese: fragmentjes van klein naar groot afgelezen door
sensor (van L -> R = van klein -> groot)
o Aflezen elektroforegram:




§ 1-30bp: niet afleesbaar
§ Meestal 500-700bp goede sequenAe afleesbaar (max 1000bp)
§ Sorware met kwaliteitsscore: Phred-score
• Phred score Q = -10*log10(P)
• P = probabiliteit van fouAeve base call




o FASTQ file (output na sorware)
o Base call + kwaliteitsscore
§ Hier is baseline Phred score 20
• Balkje omhoog = > 20
• Balkje omlaag = < 20
§ Phred score 50: 99,999% zekerheid voor
bepaald NT
o Lage kwaliteit: vaak veel GCs (3e OH brug = moeilijk
denatureerbaar)
§ Gevolg: lusjesvorming = kleinere fragmenten =
overlap met andere fragmenten
- Nadelen:
o Beperkt tot 500NT (lage throughput)
o Moeite met herhalingen
ð Best 2 aparte reacAes (betrouwbaarheid)
o FW of RV primer, om beide richAngen af te lezen


3

, o & check: sequenAefout of mutaAe




HGP = verwezenlijkingen Sanger-sequencing
- DNA van # individuen => Humane genoom/referenAegenoom
- Methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode
o Clones in YACs (+++ grote fragmenten), BACs, P1s, cosmiden
o Mapping via southern bloxng

Tegelijk: parallel project door bedrijf
- Craig Venter
- Stalen > 5 individuen (oa zichzelf)
- Methode:
o Whole genome shotgun sequencing (random clones, geen mapping)
o Heel genoom random gefragmenteerd en speciale sorware ontwikkeld
o Zijn voordeel: om de 24u werden stukjes van HGP vrijgekomen

Nieuwe uitdagingen
- Volledige sequenAe (telomeer tot telomeer)
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenAes
- Persoonlijke genoomsequenAe van iedereen

Mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
- Kennis DNA volgorde & SNPs => diangose, prognose, prevenAe
- Farmacogenomics: verklaren waarom & of individuen slecht reageren op
geneesmiddelen



4