Leerdoelen Cellen en Weefsels
Chapter 5: DNA Replication and Repair
Explain the mechanisms for the maintenance of DNA sequences and their importance in genetic stability.
• DNA-replicatie: Dit proces, uitgevoerd door eiwitmachines, zorgt voor de nauwkeurige duplicatie van
genetische informatie voordat een cel zich deelt. De nauwkeurigheid is opmerkelijk hoog, met slechts
ongeveer één fout per 10^10 gekopieerde nucleotiden. De hoge betrouwbaarheid van de replicatie is
afhankelijk van complementaire basenparing en verschillende opeenvolgende proofreading
mechanismen.
• DNA-herstel (DNA Repair): Dit omvat de voortdurende surveillance en reparatie van genetische
informatie, die voortdurend wordt beschadigd door hitte, metabolische ongevallen, straling, en
reactieve moleculen. De meeste spontane veranderingen zijn tijdelijk omdat ze onmiddellijk worden
gecorrigeerd door DNA-herstelenzymen.
De overleving van een individueel organisme vereist een hoge mate van genetische stabiliteit. Lage
mutatiefrequenties zijn noodzakelijk voor het leven zoals we dat kennen:
• Germ-line stabiliteit: Het handhaven van stabiliteit in de kiemcellen (germ cells) is cruciaal voor de
instandhouding van de soort, aangezien mutaties anders zouden accumuleren en de
levensvatbaarheid van de volgende generatie zouden bedreigen.
• Somatische cel stabiliteit: Stabiliteit in somatische cellen (lichaamscellen) is nodig om de
georganiseerde structuur van het lichaam te behouden. Nucleotideveranderingen in somatische cellen
kunnen leiden tot de ongecontroleerde celproliferatie die bekend staat als kanker.
Describe the sources of mutation rates in DNA and their impact on genetic variation.
• Spontane chemische reacties (Hydrolytische schade):
o Depurinatie: het verlies van purinebasen (adenine en guanine) door hydrolyse van de N-
glycosylbinding. dit gebeurt ongeveer 18.000 keer per dag in een menselijke cel.
Ongecorrigeerd kan dit leiden tot het verlies van een nucleotidepaar na replicatie.
o Deaminatie: de spontane omzetting van cytosine naar uracil (ongeveer 100 basen per dag).
Deaminatie van 5-methylcytosine produceert thymine, wat resulteert in een misparing (T-G).
• Oxidatieve schade en Reactieve Moleculen: schade door reactieve metabolieten die in de cel worden
geproduceerd, zoals de vorming van 8-oxoguanine en ring-verzadigde pyrimidines.
• Straling en chemicaliën:
o Ultraviolet (UV) straling: veroorzaakt de vorming van pyrimidinedimeren (zoals thymine-
dimeren), waarbij twee aangrenzende pyrimidinebasen covalent met elkaar verbonden
raken.
o Ioniserende straling en oxidatiemiddelen: veroorzaken dubbelstrengsbreuken, een bijzonder
gevaarlijke vorm van DNA-schade.
• Mutatiepercentages en Impact op Genetische Variatie: de mutatiesnelheid is extreem laag dankzij de
reparatiemechanismen. Hoewel de cel er alles aan doet om het DNA te beschermen, zijn af en toe
veranderingen in de DNA-sequenties onvermijdelijk. Deze veranderingen (mutaties) zijn essentieel
omdat ze de genetische variatie produceren die nodig is voor natuurlijke selectie om de evolutie van
organismen aan te drijven. Als de mutatiefrequentie significant hoger zou zijn, zou dit een rampzalige
toename van kanker veroorzaken en de complexiteit van organismen beperken.
,Differentiate between various DNA polymerases and explain their roles in replication fidelity and
proofreading.
DNA-polymerasen (DNA Pol) zijn enzymen die de polymerisatie van nucleotiden in de 5'-naar-3' richting
katalyseren. De hoge betrouwbaarheid is gebaseerd op twee opeenvolgende proofreading-mechanismen:
1. Initiële selectie/Conformationele verandering: de DNA-polymerase katalyseert de synthese van
nucleotiden in de 5'-naar-3' richting, waarbij complementaire basenparing de initiële selectie van de
juiste nucleotiden begeleidt. De polymerase voert een eerste "proofreading" uit doordat het enzym
een conformatieverandering moet ondergaan om het nucleotide toe te voegen, wat gemakkelijker
gebeurt bij correcte basenparing.
• De intrinsieke foutenmarge van de polymerisatie is ongeveer 1 op 10^5 nucleotiden.
2. Exonucleolytische proofreading (3'→5'): dit vindt plaats direct nadat een zeldzame verkeerde
nucleotide is toegevoegd. DNA Pols hebben een aparte katalytische site/pocket (de editing site) met
een 3'→5' proofreading exonuclease. Dit exonuclease knipt verkeerd gepaarde residuen aan het 3'-OH
uiteinde van de primerstreng af totdat een correct gepaarde 3'-OH terminus is geregenereerd, waarna
de synthese kan doorgaan.
• Dit proces vermindert de foutenmarge met een factor 10^2.
3. Strand-directed Mismatch Repair (MMR): dit is het derde en laatste proofreading-systeem dat zich
richt op de zeldzame replicatiefouten die door de polymerase en zijn exonuclease zijn gemist. Het
MMR-systeem herkent de mismatched base pairs die achter de replicatievork zijn achtergelaten. Om
effectief te zijn, moet dit systeem de nieuw gesynthetiseerde streng kunnen onderscheiden van de
oude (template) streng.
• Door de foutieve nucleotide op de nieuwe streng te verwijderen en te vervangen, reduceert
de MMR het aantal fouten gemaakt tijdens replicatie met een extra factor van 100 tot 1000.
Typen Eukaryotische DNA Polymerasen bij de Replicatievork (Fig. 5-19): Eukaryoten gebruiken drie
verschillende soorten DNA-polymerase bij elke replicatievork:
• Polymerase ε (Polε): Synthetiseert de leidende streng (leading strand). Het bindt aan de sliding clamp
en de helicase en kan zeer lange stukken DNA synthetiseren zonder los te laten.
• Polymerase α (Polα): Bevat DNA primase als een van zijn subeenheden. Het start alle nieuwe ketens
door eerst een kort stukje RNA te synthetiseren (de primer), gevolgd door slechts ongeveer 20
nucleotiden DNA, waarna het dissocieert.
• Polymerase δ (Polδ): Neemt de synthese over van Polα en voltooit de synthese van elk Okazaki-
fragment op de achterblijvende streng (lagging strand).
Translesie DNA polymerasen zijn gespecialiseerde, maar minder nauwkeurige back-up polymerasen die in
noodsituaties worden ingezet wanneer de zeer nauwkeurige replicatieve DNA-polymerasen vastlopen bij
beschadigd DNA. Ze missen exonucleolytische proofreading-activiteit en zijn minder selectief in het kiezen van
nucleotiden. Ze worden strak gereguleerd en geactiveerd door covalente modificaties van de sliding clamp bij
DNA-schade, waardoor ze tijdelijk de schade kunnen omzeilen (bypassen).
Describe the functions of DNA replication enzymes, including primase, helicase, single-strand binding
proteins, sliding clamp, and clamp loader.
1. DNA Helicase: Scheidt de twee ouder-DNA-strengen vóór de replicatievork. Helicases hydrolyseren
ATP om zichzelf snel langs een enkele DNA-streng te bewegen en zo de helix open te wrikken. De
eukaryotische replicatieve helicase is de CMG helicase (bestaande uit 11 subunits).
2. DNA Primase: Synthetiseert korte RNA-primers op de achterblijvende streng (lagging strand). Dit is
een RNA-polymerase dat, in tegenstelling tot DNA-polymerase, de synthese van een nieuwe
polynucleotideketen de novo kan starten, zonder een base-gepaard 3'-OH uiteinde.
, 3. Single-Strand DNA-Binding (SSB) Proteins: Binden strak en coöperatief aan de enkelstrengs DNA-
gebieden die door helicase zijn blootgesteld. Ze coaten en strekken deze enkelstrengen, waardoor
wordt voorkomen dat ze korte hairpin-helices vormen die de DNA-synthese zouden belemmeren.
4. Sliding Clamp (bijv. PCNA in eukaryoten): Vormt een grote ring rond de DNA-dubbele helix en houdt
de DNA-polymerase stevig op het DNA terwijl deze beweegt. Dit accessoire-eiwit voorkomt dat de
polymerase voortijdig dissocieert, waardoor lange stukken DNA gekopieerd kunnen worden.
5. Clamp Loader: Een speciaal eiwitcomplex dat ATP hydrolyseert om de ringvormige sliding clamp te
openen en te sluiten, waardoor deze op de DNA-streng kan worden geladen, meestal bij een primer–
template junctie. Op de lagging strand wordt voor elk nieuw Okazaki-fragment een nieuwe clamp
geladen.
Explain the process of DNA replication initiation and the completion of DNA replication in chromosomes (Fig.
5-31).
, • Eukaryoten hebben meerdere Origins of replications (ORI’s); sommige worden vaker gebruikt in
replicatie in anderen. Er zit ook meer diversiteit in de ORI’s waardoor ze lastiger te herkennen zijn dan
de ORI’s van bacteriën.
1. G1-fase (Licensing): het Origin Recognition Complex (ORC) bindt aan de replicatie-oorsprong en is
gebonden aan het eiwit cdc6. De ORC laadt een symmetrisch complex van twee inactieve Mcm-
helicases (de kernen van de replicatieve helicases) die gebonden zijn aan cdt1 op het dubbelstrengs
DNA (na binding laat cdt1 los). Dit gebeurt wanneer de activiteit van gespecialiseerde proteïnekinasen
laag is.
2. Overgang G1 naar S-fase (Activatie): bij de overgang naar de S-fase stijgt de activiteit van deze
proteïnekinasen. De kinasen fosforyleren zowel de Mcm-helicases (waardoor ze worden geactiveerd)
als de ORC (waardoor deze wordt gedeactiveerd en voorkomt dat er nieuwe helicases worden
geladen).
3. Vorming replicatievorken: er worden extra eiwitten (Cdc45 en GINS) geladen om de actieve
replicatieve helicases, bekend als CMG helicases, te voltooien. De twee CMG helicases worden
geladen op de afzonderlijke enkelstrengen en beginnen in tegengestelde richtingen te bewegen,
waarbij ze de DNA-dubbele helix openen. De ORC wordt verplaatst.
4. Synthese: DNA Polymerase α en ε worden geladen. Pol ε start de synthese van de leidende streng,
terwijl Pol α de primers levert voor de achterblijvende streng, die vervolgens wordt verlengd door Pol
δ. Dit creëert twee replicatievorken die in tegengestelde richting bewegen.
5. In eukaryoten stoppen replicatievorken wanneer ze elkaar frontaal tegenkomen (head-on encounter)
of wanneer ze het einde van het chromosoom tegenkomen. Wanneer twee vorken elkaar ontmoeten,
wordt de CMG-helicase bij elke vork covalent gemodificeerd door ubiquitinatie, wat de demontage en
verwijdering ervan van het DNA veroorzaakt. De resterende gaten in het DNA worden opgevuld en
verzegeld door reparatie-DNA-polymerase en DNA-ligase.
Bacteriën:
1. Bacteriën hebben 1 ORI en circulair DNA.
1. De ORI is A-T rijk (deze bindingen zijn zwakker dan G-C bindingen), de initiator eiwitten gaat daar op
het membraan zitten en destabiliseren het DNA om de strengen een klein stukje van elkaar te trekken
waardoor helicase kan binden.
2. De twee helicases (een gaat de ene kant op en de andere de andere kant) binden aan het DNA en
openen de streng verder.
3. DNA primase bind en DNA synthese zal plaatsvinden.
4. In de replicatie vork is er een delay met de methylatie van het nieuw gesynthetiseerde DNA. Na de
refractory period zal het DNA worden gemethyleerd door DAN (DNA adenine methyltransferase). Als
de gehele nieuwe streng is gemethyleerd kan er een nieuwe ronde van replicatie ontstaan.
Chapter 5: DNA Replication and Repair
Explain the mechanisms for the maintenance of DNA sequences and their importance in genetic stability.
• DNA-replicatie: Dit proces, uitgevoerd door eiwitmachines, zorgt voor de nauwkeurige duplicatie van
genetische informatie voordat een cel zich deelt. De nauwkeurigheid is opmerkelijk hoog, met slechts
ongeveer één fout per 10^10 gekopieerde nucleotiden. De hoge betrouwbaarheid van de replicatie is
afhankelijk van complementaire basenparing en verschillende opeenvolgende proofreading
mechanismen.
• DNA-herstel (DNA Repair): Dit omvat de voortdurende surveillance en reparatie van genetische
informatie, die voortdurend wordt beschadigd door hitte, metabolische ongevallen, straling, en
reactieve moleculen. De meeste spontane veranderingen zijn tijdelijk omdat ze onmiddellijk worden
gecorrigeerd door DNA-herstelenzymen.
De overleving van een individueel organisme vereist een hoge mate van genetische stabiliteit. Lage
mutatiefrequenties zijn noodzakelijk voor het leven zoals we dat kennen:
• Germ-line stabiliteit: Het handhaven van stabiliteit in de kiemcellen (germ cells) is cruciaal voor de
instandhouding van de soort, aangezien mutaties anders zouden accumuleren en de
levensvatbaarheid van de volgende generatie zouden bedreigen.
• Somatische cel stabiliteit: Stabiliteit in somatische cellen (lichaamscellen) is nodig om de
georganiseerde structuur van het lichaam te behouden. Nucleotideveranderingen in somatische cellen
kunnen leiden tot de ongecontroleerde celproliferatie die bekend staat als kanker.
Describe the sources of mutation rates in DNA and their impact on genetic variation.
• Spontane chemische reacties (Hydrolytische schade):
o Depurinatie: het verlies van purinebasen (adenine en guanine) door hydrolyse van de N-
glycosylbinding. dit gebeurt ongeveer 18.000 keer per dag in een menselijke cel.
Ongecorrigeerd kan dit leiden tot het verlies van een nucleotidepaar na replicatie.
o Deaminatie: de spontane omzetting van cytosine naar uracil (ongeveer 100 basen per dag).
Deaminatie van 5-methylcytosine produceert thymine, wat resulteert in een misparing (T-G).
• Oxidatieve schade en Reactieve Moleculen: schade door reactieve metabolieten die in de cel worden
geproduceerd, zoals de vorming van 8-oxoguanine en ring-verzadigde pyrimidines.
• Straling en chemicaliën:
o Ultraviolet (UV) straling: veroorzaakt de vorming van pyrimidinedimeren (zoals thymine-
dimeren), waarbij twee aangrenzende pyrimidinebasen covalent met elkaar verbonden
raken.
o Ioniserende straling en oxidatiemiddelen: veroorzaken dubbelstrengsbreuken, een bijzonder
gevaarlijke vorm van DNA-schade.
• Mutatiepercentages en Impact op Genetische Variatie: de mutatiesnelheid is extreem laag dankzij de
reparatiemechanismen. Hoewel de cel er alles aan doet om het DNA te beschermen, zijn af en toe
veranderingen in de DNA-sequenties onvermijdelijk. Deze veranderingen (mutaties) zijn essentieel
omdat ze de genetische variatie produceren die nodig is voor natuurlijke selectie om de evolutie van
organismen aan te drijven. Als de mutatiefrequentie significant hoger zou zijn, zou dit een rampzalige
toename van kanker veroorzaken en de complexiteit van organismen beperken.
,Differentiate between various DNA polymerases and explain their roles in replication fidelity and
proofreading.
DNA-polymerasen (DNA Pol) zijn enzymen die de polymerisatie van nucleotiden in de 5'-naar-3' richting
katalyseren. De hoge betrouwbaarheid is gebaseerd op twee opeenvolgende proofreading-mechanismen:
1. Initiële selectie/Conformationele verandering: de DNA-polymerase katalyseert de synthese van
nucleotiden in de 5'-naar-3' richting, waarbij complementaire basenparing de initiële selectie van de
juiste nucleotiden begeleidt. De polymerase voert een eerste "proofreading" uit doordat het enzym
een conformatieverandering moet ondergaan om het nucleotide toe te voegen, wat gemakkelijker
gebeurt bij correcte basenparing.
• De intrinsieke foutenmarge van de polymerisatie is ongeveer 1 op 10^5 nucleotiden.
2. Exonucleolytische proofreading (3'→5'): dit vindt plaats direct nadat een zeldzame verkeerde
nucleotide is toegevoegd. DNA Pols hebben een aparte katalytische site/pocket (de editing site) met
een 3'→5' proofreading exonuclease. Dit exonuclease knipt verkeerd gepaarde residuen aan het 3'-OH
uiteinde van de primerstreng af totdat een correct gepaarde 3'-OH terminus is geregenereerd, waarna
de synthese kan doorgaan.
• Dit proces vermindert de foutenmarge met een factor 10^2.
3. Strand-directed Mismatch Repair (MMR): dit is het derde en laatste proofreading-systeem dat zich
richt op de zeldzame replicatiefouten die door de polymerase en zijn exonuclease zijn gemist. Het
MMR-systeem herkent de mismatched base pairs die achter de replicatievork zijn achtergelaten. Om
effectief te zijn, moet dit systeem de nieuw gesynthetiseerde streng kunnen onderscheiden van de
oude (template) streng.
• Door de foutieve nucleotide op de nieuwe streng te verwijderen en te vervangen, reduceert
de MMR het aantal fouten gemaakt tijdens replicatie met een extra factor van 100 tot 1000.
Typen Eukaryotische DNA Polymerasen bij de Replicatievork (Fig. 5-19): Eukaryoten gebruiken drie
verschillende soorten DNA-polymerase bij elke replicatievork:
• Polymerase ε (Polε): Synthetiseert de leidende streng (leading strand). Het bindt aan de sliding clamp
en de helicase en kan zeer lange stukken DNA synthetiseren zonder los te laten.
• Polymerase α (Polα): Bevat DNA primase als een van zijn subeenheden. Het start alle nieuwe ketens
door eerst een kort stukje RNA te synthetiseren (de primer), gevolgd door slechts ongeveer 20
nucleotiden DNA, waarna het dissocieert.
• Polymerase δ (Polδ): Neemt de synthese over van Polα en voltooit de synthese van elk Okazaki-
fragment op de achterblijvende streng (lagging strand).
Translesie DNA polymerasen zijn gespecialiseerde, maar minder nauwkeurige back-up polymerasen die in
noodsituaties worden ingezet wanneer de zeer nauwkeurige replicatieve DNA-polymerasen vastlopen bij
beschadigd DNA. Ze missen exonucleolytische proofreading-activiteit en zijn minder selectief in het kiezen van
nucleotiden. Ze worden strak gereguleerd en geactiveerd door covalente modificaties van de sliding clamp bij
DNA-schade, waardoor ze tijdelijk de schade kunnen omzeilen (bypassen).
Describe the functions of DNA replication enzymes, including primase, helicase, single-strand binding
proteins, sliding clamp, and clamp loader.
1. DNA Helicase: Scheidt de twee ouder-DNA-strengen vóór de replicatievork. Helicases hydrolyseren
ATP om zichzelf snel langs een enkele DNA-streng te bewegen en zo de helix open te wrikken. De
eukaryotische replicatieve helicase is de CMG helicase (bestaande uit 11 subunits).
2. DNA Primase: Synthetiseert korte RNA-primers op de achterblijvende streng (lagging strand). Dit is
een RNA-polymerase dat, in tegenstelling tot DNA-polymerase, de synthese van een nieuwe
polynucleotideketen de novo kan starten, zonder een base-gepaard 3'-OH uiteinde.
, 3. Single-Strand DNA-Binding (SSB) Proteins: Binden strak en coöperatief aan de enkelstrengs DNA-
gebieden die door helicase zijn blootgesteld. Ze coaten en strekken deze enkelstrengen, waardoor
wordt voorkomen dat ze korte hairpin-helices vormen die de DNA-synthese zouden belemmeren.
4. Sliding Clamp (bijv. PCNA in eukaryoten): Vormt een grote ring rond de DNA-dubbele helix en houdt
de DNA-polymerase stevig op het DNA terwijl deze beweegt. Dit accessoire-eiwit voorkomt dat de
polymerase voortijdig dissocieert, waardoor lange stukken DNA gekopieerd kunnen worden.
5. Clamp Loader: Een speciaal eiwitcomplex dat ATP hydrolyseert om de ringvormige sliding clamp te
openen en te sluiten, waardoor deze op de DNA-streng kan worden geladen, meestal bij een primer–
template junctie. Op de lagging strand wordt voor elk nieuw Okazaki-fragment een nieuwe clamp
geladen.
Explain the process of DNA replication initiation and the completion of DNA replication in chromosomes (Fig.
5-31).
, • Eukaryoten hebben meerdere Origins of replications (ORI’s); sommige worden vaker gebruikt in
replicatie in anderen. Er zit ook meer diversiteit in de ORI’s waardoor ze lastiger te herkennen zijn dan
de ORI’s van bacteriën.
1. G1-fase (Licensing): het Origin Recognition Complex (ORC) bindt aan de replicatie-oorsprong en is
gebonden aan het eiwit cdc6. De ORC laadt een symmetrisch complex van twee inactieve Mcm-
helicases (de kernen van de replicatieve helicases) die gebonden zijn aan cdt1 op het dubbelstrengs
DNA (na binding laat cdt1 los). Dit gebeurt wanneer de activiteit van gespecialiseerde proteïnekinasen
laag is.
2. Overgang G1 naar S-fase (Activatie): bij de overgang naar de S-fase stijgt de activiteit van deze
proteïnekinasen. De kinasen fosforyleren zowel de Mcm-helicases (waardoor ze worden geactiveerd)
als de ORC (waardoor deze wordt gedeactiveerd en voorkomt dat er nieuwe helicases worden
geladen).
3. Vorming replicatievorken: er worden extra eiwitten (Cdc45 en GINS) geladen om de actieve
replicatieve helicases, bekend als CMG helicases, te voltooien. De twee CMG helicases worden
geladen op de afzonderlijke enkelstrengen en beginnen in tegengestelde richtingen te bewegen,
waarbij ze de DNA-dubbele helix openen. De ORC wordt verplaatst.
4. Synthese: DNA Polymerase α en ε worden geladen. Pol ε start de synthese van de leidende streng,
terwijl Pol α de primers levert voor de achterblijvende streng, die vervolgens wordt verlengd door Pol
δ. Dit creëert twee replicatievorken die in tegengestelde richting bewegen.
5. In eukaryoten stoppen replicatievorken wanneer ze elkaar frontaal tegenkomen (head-on encounter)
of wanneer ze het einde van het chromosoom tegenkomen. Wanneer twee vorken elkaar ontmoeten,
wordt de CMG-helicase bij elke vork covalent gemodificeerd door ubiquitinatie, wat de demontage en
verwijdering ervan van het DNA veroorzaakt. De resterende gaten in het DNA worden opgevuld en
verzegeld door reparatie-DNA-polymerase en DNA-ligase.
Bacteriën:
1. Bacteriën hebben 1 ORI en circulair DNA.
1. De ORI is A-T rijk (deze bindingen zijn zwakker dan G-C bindingen), de initiator eiwitten gaat daar op
het membraan zitten en destabiliseren het DNA om de strengen een klein stukje van elkaar te trekken
waardoor helicase kan binden.
2. De twee helicases (een gaat de ene kant op en de andere de andere kant) binden aan het DNA en
openen de streng verder.
3. DNA primase bind en DNA synthese zal plaatsvinden.
4. In de replicatie vork is er een delay met de methylatie van het nieuw gesynthetiseerde DNA. Na de
refractory period zal het DNA worden gemethyleerd door DAN (DNA adenine methyltransferase). Als
de gehele nieuwe streng is gemethyleerd kan er een nieuwe ronde van replicatie ontstaan.
