Samenvatting Real Time PCR

Real Time PCR – SPPO - BMO3
PCR remmers
Remmers tijdens monstervoorbereiding PCR:
 Nucleïnezuren interferen met oppervlakken van opslag ruimten
 Stoffen kunnen reageren met nucleïnezuren tijdens monster verwerking en
extracties
 Stoffen kunnen reverse transcriptie remmen
 Stoffen kunnen het template breken of modificeren
 Primer annealing aan het template kan worden belemmerd
 DNA polymerase kan worden afgebroken, geremd of veranderd
 Stoffen kunnen de bindingen van probes of fluoroforen verstoren.

EDTA  Remt PCR door metaalionen te binden, zoals Mg 2+ .
 Polymerase gebruikt Mg als cofactor om polymerisatie van nucleotiden
mogelijk te maken.
 EDTA aanwezig binden Mg ionen waardoor ze niet meer beschikbaar zijn
voor het polymerase  verminderd PCR amplificatie
Ureum  leidt tot denatureatie van enzymen, inclusief DNA polymerase 
verlaagd efficiëntie
Hoge [zout]  Invloed op annealing en polymerase activiteit  minder specifieke
en efficiënte amplificatie

RNA isolatie methoden
Ribonucleïnezuur (RNA)  enkelstrengs nucleïnezuur dat bestaat uit keten van
nucleotiden opgebouwd uit ribosesuiker, fosfaatgroep en vier stikstof basen (A, U,
C, G)
 Wordt gevormd door transcripie, waarbij DNA wordt gekopieerd in RNA
 Messenger RNA (mRNA) 5%  draagt genetische informatie van DNA naar
ribosomen, fungeert als een blauwdruk voor eiwitsynthese
 Transfer RNA (tRNA)  transporteren van aminozuren naar ribosomen
tijdens eiwitsynthese, herkent codons op mRNA en voegt juiste AZ toe aan
eiwitketen.
 Ribosomaal RNA (rRNA) 85%  structureel en functioneel onderdeel van
ribosomen, helpt bij samenvoegen van AZ in juiste volgorden volgen
mRNA.
 Enkelstrengs
 Bevat Uracil (U) ipv Thymine (T)
 Bevat ribose, een suiker met één zuurstof atoom meer dan deoxyribose in
DNA
 RNA kan uit het cytoplasma gehaald worden en DNA blijft in de kern

Ribonuclease (RNase)  enzym dat RNA-molecullen afbreekt door de fosfodi-
esterbinding tussen nucleotiden in de RNA keten verbreekt.
 Afbraak RNA in individuele nucleotiden, cruciaal voor reguleren van
levensduur RNA
 Rijping van RNA moleculen, knippen voorloper molecuul om ze functioneel
te maken
 Onderdeel van immuunrespons, kunnen viraal RNA herkennen en afbreken
 Ruimen beschadigd of defect RNA op, zodat ze geen problemen
veroorzaken
 Regulatie van genexpressie, degraderen mRNA om hoeveelheid productie
eiwit te reguleren.
Opslag van RNA:
 Opslag moet in RNase-Vrije omstandigheden

,  Op ijs voor korte periode, vriezer voor langere periode
 Eventueel RNase remmer toevoegen
 Veel gebruikte oplossingen:
o 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0
o 0,1 M EDTA
Tripure extractie  methode voor het isoleren van RNA uit biologische monsters,
gebaseerd op een fenol-chloroformextractie.
 Een monofasische oplossing van fenol en guanidinethiocyanaat (GITC) en
chloroform. Wat celmembranen afbreekt en homogene oplossing creëert
van componenten
 Cloroform zorgt voor fase separatie
o Waterige fase  RNA
o Intermediaire fase  voornamelijk DNA
o Organische fase  eiwitten en andere
vetachtige componenten.
 Aanwezigheid van Fenol zorgt voor zure omgeving
waardoor RNA in waterige fase bevind.
 Bij pH 7-8 zijn fosfaatdiesters in de nucleïnezuren
negatief geladen en bevind het DNA en RNA zich in
de waterige fase
 Bij pH 4-6 verschijnen de meeste eiwitten en kleine DNA fragmenten in de
organische fase en blijven grote DNA fragmenten in de innerfase.

Silica kolom  gebruikt voor zuiveren van nucleïnezuren zoals DNA en RNA in
moleculaire biologie
 Grote affiniteit voor nucleïnezuren die binden aan silica oppervlak.
 Interacties tussen negatief geladen DNA/RNA en het positief geladen silica
in buffer met hoge [zout]
 Onzuiverheden worden weggespoeld door te wassen met buffer die
nucleïnezuren gebonden houdt.
 Dmv elutie buffer worden nucleïnezuren vrijgemaakt uit kolom

Guanidine-isothiocyanaat-lysisbuffer  krachtige denaturerende oplossing die
wordt gebruikt voor lyseren van cellen en isoleren van RNA en DNA uit
biologische monsters
 Breek celmembranen af en inactiveren nucleasen waardoor genetisch
materiaal intact blijft.
 Beschermd RNA tegen afbraak van RNase

RNA-extractie met Dynabeads  techniek die gebruik wordt voor het isoleren van
RNA uit biologische monsters, maakt van magnetische kralen gecoat met
specifieke moleculen die binden aan doelwit molecuul voor snelle en efficiënte
isolatie met behulp van magneet
 Dynabeads  kleine, super paramagnetische kralen die worden gebruikt
voor isolatie van specifieke biomoleculen.
 Bioreactieve moleculen worden geabsorbeerd of gekoppeld aan het
oppervlak van de kralen om nucleïnezuren of eiwitten te scheiden.
 Maakt gebruik van de poly(A)-staart aanwezig op het 3’ uiteinde van mRNA
moleculen

,  mRNA scheiden van andere RNA typen zoals rRNA en tRNA.




RNA-extratie met SPRI-kralen  Techniek die gebruikt
wordt voor het isoleren van RNA uit biologische monsters,
maakt gebruik van magnetische kralen die binden aan
nucleïnezuren.
 SPRI-beads  Solid Phase Reversible Immobilization
zijn magnetische kralen die nucleïnezuren efficiënt
kunnen binden onder specifieke omstandigheden
 Door aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) en zout bind DNA
revisible aan paramagnetische kralen bedekt met silica en
carboxylgroepen
 Selecteert nucleïnezuren op basis van grootte
 RNA vormt een neerslag met zout en PEG op de SPRI-beads, terwijl andere
componenten in oplossing blijven
 PEG:zoutverhouding stimuleert het binden van RNA (-) aan
carboxylgroepen op het kralen oppervlak op basis van RNA lengte.

RNA kwantiteit controle
Nanofotometer  snelle nauwkeurige RNA kwantificeren met behulp van kleine
monstervolumes.
 260: concentratie nucleïnezuren
 280: concentratie eiwitten, hoge absorptie duid op eiwitcontaminatie
 230: concentratie chemische verontreinigingen, hoge absorptie duid op
verontreiniging
 260:280 voor zuiver DNA tussen 1,8 en 2,0  lager 1,8 duid op
eiwitcontaminatie
 260:230 voor zuiver DNA tussen 2,0 en 2,2  lager 2,0 duid op chemische
contaminatie

Echter vertonen de vijf nucleotiden van DNA en RNA een uiteenlopende 260:280
ratio als elk nucleotiden onafhankelijk word gemeten:
 Guanine: 1,15
 Adenine: 4,50
 Cytosine: 1,51
 Uracil: 4,00
 Thymine: 1,47
Hieruit blijkt dat RNA een hogere absorptie heeft dan DNA door de aanwezigheid
van uracil. Als de 260:280 ratio een waarde heeft van 2,0 kan dit dus ook RNA
contaminatie zijn.

Extinctiecoëfficiënten of constanten voor nucleïnezuren:
 dsDNA: 50 ng-cm/µl