Biomethoden samenvatting jaar 2
medische diagnostiek
H7.7
● Primaire fluorescentie→ stoffen die onder UV licht vanuit zichzelf
fluoresceren
● Secundaire fluorescentie→ stoffen die fluorescentie kleurstoffen bevatten
die onder invloed van UV licht kunnen fluoresceren
● Meest gebruikte lichtbronnen in fluorescentie microscopen zijn: high pressure
mercury vapour of xenon arc lampen
● Halogeenlampen kunnen een hoge hoeveelheid UV uitstralen, maar vallen in het
blauwe spectrum, dus zijn daarvoor niet algemeen
● Soorten microscopen
○ Transmissie: de lichtbron bevindt zich onder het
sample
○ Incident: sample wordt van bovenaf verlicht, tegen een
zwarte achtergrond
● Transmissie
○ Excitatie filter: tussen de lichtbron en de condensor
○ Barrier filter: in het oogstuk
○ Het excitatie filter zorgt ervoor dat het sample wordt
verlicht door een bepaalde hoeveelheid UV licht en
golflengte
○ De barrier filter zorgt ervoor dat alleen het
geëmitteerde licht wordt doorgelaten en niet
het ongebruikte UV licht→ lastig, omdat het
signaal van fluorescentie hierdoor lager wordt
■ Alternatief is een zwarte condensor, waardoor
alleen het geëmitteerde licht wordt weerkaatst
● Incident
○ Sample wordt vanaf bovenaf verlicht→ gaat
eerst door een excitatie filter en daarna door
een prisma of dichromatische spiegel naar het
sample, zichtbaar licht wordt doorgelaten in
tegengestelde richting van het excitatielicht
○ Resultaat: licht sample tegen een donkere achtergrond
○ Voordelen: geeft een intensiever resultaat (lichter,
namelijk geen barrier filter) en er kunnen ook andere
transmissie bronnen worden gebruikt
● Toepassing fluorescentie microscopie: immunofluorescence
(antigeen- antilichaam interacties met fluorochromen)
1
,H 9.1 t/m 9.3
● Radiatie is de emissie of transfer van energie als elektromagnetische golven of
deeltjes
○ Deeltjes zijn vaak fotonen
● λ=c/vc/v
○ λ=c/v golflengte
○ c=c/v lichtsnelheid
○ v=c/v frequentie
● E=c/v h*c/λ=c/v h * v
○ E=c/v energie
○ h=c/v constante van Planck
● Radiatie kan worden geabsorbeerd of verspreid, wanneer
deze een interactie aangaat met materie
○ Rayleigh scatter (verspreiding) houdt in dat een
foton een botsing aangaat met een atoom of
molecuul en daardoor van richting verandert
○ Kan worden gebruikt om de moleculaire massa
van deeltjes te bepalen
● Chromofoor=c/v een deeltje dat bij absorptie van energie geëxciteerd raakt
● Fluorescentie=c/v wanneer een deeltje in geëxciteerde staat een foton (of deeltje)
verliest en daardoor energie kwijtraakt
○ Verschil met fotofluorescentie→ deze blijft namelijk doorgaan met
het emitteren van licht (neemt geleidelijk af) terwijl bij fluorescentie
dit direct wegvalt wanneer het excitatielicht wordt weggehaald
● Quantum=c/v de kleinste hoeveelheid individuele energie (die wordt uitgezonden of
geabsorbeerd)
● Om een foton te kunnen absorberen, dient de hoeveelheid energie van de foton
gelijk te staan aan het energieverschil van de ground state en de geëxciteerde staat
● Een transitie is het schakelen tussen energieniveaus
● De ground state is lager in energie niveau dan de geëxciteerde staat (dus de
geëmitteerde staat is lager)
H 9.7
● De golflengte van het geëxciteerde licht
is korter dan de golflengte van het
geëmitteerde licht
○ Excitatie heeft meer energie
○ Emissie heeft minder energie
● Het verschil tussen de golflengten van
excitatie en emissie wordt stokes shift
genoemd
● Fluorimeter
2
, ○ Een monochromator (in een spectrofotometer) kan de juiste golflengte kiezen
die door het cuvet gaat
○ De tweede monochromator zorgt ervoor dat alleen het geëmitteerde licht door
de detector gaat
○ Voordeel: specifieker dan UV spectrofotometer/ zichtbaar licht en kan de
nauwkeuriger de excitatie golflengte bepalen
○ Nadeel: gevoelig voor pH verandering en contaminatie
○ Toepassing: bij het detecteren van PKU
○ Quenching: wanneer het geëmitteerde licht minder is dan verwacht, kan
komen door absorberende stoffen of stoffen die interfereren met de energie
transfer
H 9.9
● Massaspectrometrie meet de massa/ lading verhouding van deeltjes
○ De moleculaire massa wordt vaak uitgedrukt in Da
■ 1Da staat gelijk aan de massa van 1 H atoom, neutron of proton
○ Kan ook informatie geven over de chemische structuur of primaire structuur
● Massaspectrometrie
○ Bestaat uit drie elementen: ionizer, analyser en detector
○ Alle onderdelen bevinden
zich in vacuüm van 10-2 tot
10-10 Pa om botsingen
tussen de deeltjes te
voorkomen→ verhoogt
de nauwkeurigheid
○ Deeltjes moeten worden
geïoniseerd door het
koppelen van een H+ of het
verwijderen van een H+
(gebeurd in de ionizer)
● Ionisatie technieken
○ MALDI
○ Electron ionization: elektronenstraal door het analyt laten
○ Chemical ionization: een gas laten botsen met het analyt
○ Fast atom bombardement: mengen met een niet vluchtige matrix en bestralen
met elektronen met veel energie (vaak van een gas als xenon of argon)
● Analysers
○ Quadrupole: bestaat uit vier circulaire staven, door het magneetveld scheiden
de ionen op basis van stabiliteit
○ Time of flight: elektrisch veld gebruikt om de ionen dezelfde kinetische
energie te geven, de snelheid is verschillend per ion
○ Quadrupole ion- trap: door voltage gescheiden
● Detectors
○ De waarde is de m/z ratio
3
medische diagnostiek
H7.7
● Primaire fluorescentie→ stoffen die onder UV licht vanuit zichzelf
fluoresceren
● Secundaire fluorescentie→ stoffen die fluorescentie kleurstoffen bevatten
die onder invloed van UV licht kunnen fluoresceren
● Meest gebruikte lichtbronnen in fluorescentie microscopen zijn: high pressure
mercury vapour of xenon arc lampen
● Halogeenlampen kunnen een hoge hoeveelheid UV uitstralen, maar vallen in het
blauwe spectrum, dus zijn daarvoor niet algemeen
● Soorten microscopen
○ Transmissie: de lichtbron bevindt zich onder het
sample
○ Incident: sample wordt van bovenaf verlicht, tegen een
zwarte achtergrond
● Transmissie
○ Excitatie filter: tussen de lichtbron en de condensor
○ Barrier filter: in het oogstuk
○ Het excitatie filter zorgt ervoor dat het sample wordt
verlicht door een bepaalde hoeveelheid UV licht en
golflengte
○ De barrier filter zorgt ervoor dat alleen het
geëmitteerde licht wordt doorgelaten en niet
het ongebruikte UV licht→ lastig, omdat het
signaal van fluorescentie hierdoor lager wordt
■ Alternatief is een zwarte condensor, waardoor
alleen het geëmitteerde licht wordt weerkaatst
● Incident
○ Sample wordt vanaf bovenaf verlicht→ gaat
eerst door een excitatie filter en daarna door
een prisma of dichromatische spiegel naar het
sample, zichtbaar licht wordt doorgelaten in
tegengestelde richting van het excitatielicht
○ Resultaat: licht sample tegen een donkere achtergrond
○ Voordelen: geeft een intensiever resultaat (lichter,
namelijk geen barrier filter) en er kunnen ook andere
transmissie bronnen worden gebruikt
● Toepassing fluorescentie microscopie: immunofluorescence
(antigeen- antilichaam interacties met fluorochromen)
1
,H 9.1 t/m 9.3
● Radiatie is de emissie of transfer van energie als elektromagnetische golven of
deeltjes
○ Deeltjes zijn vaak fotonen
● λ=c/vc/v
○ λ=c/v golflengte
○ c=c/v lichtsnelheid
○ v=c/v frequentie
● E=c/v h*c/λ=c/v h * v
○ E=c/v energie
○ h=c/v constante van Planck
● Radiatie kan worden geabsorbeerd of verspreid, wanneer
deze een interactie aangaat met materie
○ Rayleigh scatter (verspreiding) houdt in dat een
foton een botsing aangaat met een atoom of
molecuul en daardoor van richting verandert
○ Kan worden gebruikt om de moleculaire massa
van deeltjes te bepalen
● Chromofoor=c/v een deeltje dat bij absorptie van energie geëxciteerd raakt
● Fluorescentie=c/v wanneer een deeltje in geëxciteerde staat een foton (of deeltje)
verliest en daardoor energie kwijtraakt
○ Verschil met fotofluorescentie→ deze blijft namelijk doorgaan met
het emitteren van licht (neemt geleidelijk af) terwijl bij fluorescentie
dit direct wegvalt wanneer het excitatielicht wordt weggehaald
● Quantum=c/v de kleinste hoeveelheid individuele energie (die wordt uitgezonden of
geabsorbeerd)
● Om een foton te kunnen absorberen, dient de hoeveelheid energie van de foton
gelijk te staan aan het energieverschil van de ground state en de geëxciteerde staat
● Een transitie is het schakelen tussen energieniveaus
● De ground state is lager in energie niveau dan de geëxciteerde staat (dus de
geëmitteerde staat is lager)
H 9.7
● De golflengte van het geëxciteerde licht
is korter dan de golflengte van het
geëmitteerde licht
○ Excitatie heeft meer energie
○ Emissie heeft minder energie
● Het verschil tussen de golflengten van
excitatie en emissie wordt stokes shift
genoemd
● Fluorimeter
2
, ○ Een monochromator (in een spectrofotometer) kan de juiste golflengte kiezen
die door het cuvet gaat
○ De tweede monochromator zorgt ervoor dat alleen het geëmitteerde licht door
de detector gaat
○ Voordeel: specifieker dan UV spectrofotometer/ zichtbaar licht en kan de
nauwkeuriger de excitatie golflengte bepalen
○ Nadeel: gevoelig voor pH verandering en contaminatie
○ Toepassing: bij het detecteren van PKU
○ Quenching: wanneer het geëmitteerde licht minder is dan verwacht, kan
komen door absorberende stoffen of stoffen die interfereren met de energie
transfer
H 9.9
● Massaspectrometrie meet de massa/ lading verhouding van deeltjes
○ De moleculaire massa wordt vaak uitgedrukt in Da
■ 1Da staat gelijk aan de massa van 1 H atoom, neutron of proton
○ Kan ook informatie geven over de chemische structuur of primaire structuur
● Massaspectrometrie
○ Bestaat uit drie elementen: ionizer, analyser en detector
○ Alle onderdelen bevinden
zich in vacuüm van 10-2 tot
10-10 Pa om botsingen
tussen de deeltjes te
voorkomen→ verhoogt
de nauwkeurigheid
○ Deeltjes moeten worden
geïoniseerd door het
koppelen van een H+ of het
verwijderen van een H+
(gebeurd in de ionizer)
● Ionisatie technieken
○ MALDI
○ Electron ionization: elektronenstraal door het analyt laten
○ Chemical ionization: een gas laten botsen met het analyt
○ Fast atom bombardement: mengen met een niet vluchtige matrix en bestralen
met elektronen met veel energie (vaak van een gas als xenon of argon)
● Analysers
○ Quadrupole: bestaat uit vier circulaire staven, door het magneetveld scheiden
de ionen op basis van stabiliteit
○ Time of flight: elektrisch veld gebruikt om de ionen dezelfde kinetische
energie te geven, de snelheid is verschillend per ion
○ Quadrupole ion- trap: door voltage gescheiden
● Detectors
○ De waarde is de m/z ratio
3
