LES 1: INTRODUCTIE
Proteomics
Proteomics is het bepalen van een complete set proteïnen die aanwezig zijn in een systeem onder
bepaalde omstandigheden.
- vroeger werd er gefocust op één proteïne: niet veel was geweten over proteïnevariëteit
o een verandering in dit ene proteïne " men verwachtte een verandering in de cel
o dit was zeer vaak niet het geval: waarom?
o er zijn tienduizenden proteïnen in een cel " vaak veranderdde er niet extreem veel
o met de technologie van vandaag: we kunnen naar grote hoeveelheden proteïnen
kijken, de proteomen, al dan niet de complete verzameling proteïnen in een cel
- bioinformatica is belangrijk: we kunnen verschillende entiteiten verwerken, expressie
bepalen en deze vergelijken en verbinden!
- systeem kan verschillen
o bv. spreken van een klein complex: associatie van minstens 2 polypeptiden
o of van een subcellulair compartiment, tot een cel tot een heel weefsel
o tot zelfs een heel organisme! (nog niet bij mensen, eerder gisten of C. elegans bv.)
- omstandigheden kunnen verschillen
o conditie van de cel: leeftijd, differentiatie, infectie, tumor
o treatment: bv. in hypoxische condities, bij virusinfectie
o tijd na treatment: 15 min? 2 uur? 3 maanden?
§ bepaling van verschillende tijdspunten: dit is belangrijk want
§ een cel is dynamisch en verandert continu: door signaalcascades (binding)
worden nieuwe proteïnen vrijgesteld en verandert het proteoom
Waarom proteomics?
Proteïnen zijn de werkpaarden van de cel die de verschillende celfuncties effectief uitvoeren.
- 1 genomics: de bibliotheek (DNA) doet op zichzelf eigenlijk niets
- genen moeten worden omgevormd tot de werkpaarden die alle processen uitvoeren
- vergelijking met een motor
o genomics vormt een lijst van alle verschillende onderdelen van de motor
o we moeten natuurlijk weten hoe deze assembleren en samen functioneren
o proteomics onderzoekt dan hoe dit gebeurt en hoe de moto uiteindelijk rijdt
Proteogenomics:
- bij genome sequencing: het is steeds moeilijk om genen te voorspellen
- een bevestiging van het genproduct door proteomische analyse is nog steeds noodzakelijk
- dit toont het belang van proteomics nog eens aan!
1
,2. Meer proteïnen per gen
Als we een vergelijking maken tussen het aantal mRNA transcripten en de eiwitten zien we weinig
correlatie tussen beide.
" in veel gevallen is er zeker een correlatie: maar niet altijd!
" als we willen kijken naar de ‘real thing’, kijken we best naar het proteïneniveau
" in de figuur rechts: veel parallelle lijnen " voor veel mRNA is er geen corresponderend eiwit!
3.1 Posttranslationele modificaties (PTM)
Na transcriptie en translatie volgen nog de
posttranslationele modificaties.
" chemische modificatie: groepen worden
toegevoegd/verwijderd (bv. adenylatie)
" zeer dynamische processen
" ook weer niet te zien bij genomics
3.2 Alternatieve splicing
Alternatieve splicing: van één pre-mRNA molecule worden verschillende
mRNA-moleculen gevormd, waardoor er verschillende proteïnen ontstaan.
" deze hebben meestal een grote homologie
" maar er zijn dan extra of verwijderde delen
" bv. α-1 antitrypsine heeft 22 verschillende isovormen
" dit is dus niet te voorspellen door genomics
4. Proteïne interactie netwerken
Een interactienetwerk is een hogere orde van complexiteit, zonder wijziging in
aantal componenten.
" ongeveer 78% van de gistproteïnen neemt deel in een complex
" meeste celprocessen zijn gereguleerd door proteïnecomplexen en niet
door individuele prot.
" functionele proteomics: de definitie van een proteïne als een element
in een interactie-netwerk (contextuele functie), eerder dan het
toeschrijven als één functie
" genomics kan de interactie met andere componenten ook niet
voorspellen
2
,5. Cellulaire lokalisatie
Een proteïne kan gelokaliseerd worden naar één of meerdere cellulaire locaties (bv. kern, cytosol, ...)
" heeft vaak verschillende bindingspartners op verschillende locaties
" een proteïne heeft hierdoor ook vaak verschillende functies, afhankelijk van zijn lokalisatie
" dit is ook weer met genomics niet te voorspellen
Proteomics als deel van systeembiologie
Systeembiologie probeert de dynamische complexiteit van een organisme te achterhalen.
Een geïntegreerd beeld van alle aspecten van proteïnen moet hiervoor ontwikkeld worden.
- mRNA en proteïne levels en hoe deze veranderen over de tijd
o bv. tijdens de ontwikkeling of tijdens pathologische condities
- kennis over de staat en eigenschappen van alle proteïnen
o posttranslationele modificatie
o cellulaire lokalisatie
o proteolytische degradatie: synthese, lokalisatie en activiteit van proteasen
o ....
- alle proteïne-proteïne interacties in zowel ruimte als tijd in één cel
" samen met genomics en metabolomics data kan dit geïntegreerd worden naar de systeembiologie
Verschillende gezichten van proteomics
Proteomics sensu strictu vormt slechts een beschrijving: een lijst van eigenschappen: so what?
Het is per definitie ‘op grote schaal de identificatie en karakterisatie van proteïnen, incl. PTM’
Differentiële proteomics is het op grote schaal vergelijken van proteïne expressieniveaus.
- bv. bij een bepaalde pathologie: het vergelijken van een gezond en ziek sample
- zien of er dan een relatie is: verschil in hoeveelheid, extra PTM, ... " dit is differentieel
Cell-mapping proteomics gaan via studies de proteïne-proteïne interacties achterhalen.
Identificatie van proteïnen
3
, Sample preparation
Sample preparation is heel erg belangrijk: “Trash comes in, trash comes out.”
- je kan heel dure machines kopen maar ze zijn onbruikbaar als je dit niet deftig doet
- het proces van sample preparation gebeurt in verschillende stappen
a. Desintegreer weefsels en cellen en extraheer de eiwitfractie.
b. Modificeer de proteïnen voor de verdere analyse.
i. bv. denaturatie, reductie, ...
ii. afhankelijk van de methoden die je gaat gebruiken tijdens separatie,
purificatie en identificatie
Een aantal variabelen bepalen het slagen van de verdere stappen:
- methoden van cellyse en het kiezen van het juiste detergent
- pH, temperatuur
- proteolytische degradatie: toevoegen van protease inhibitoren
o proteasen van ene celtype kunnen interageren met proteïnen van het andere celtype
o inhibitoren zijn nodig om deze interactie te voorkomen
Dynamische range van proteïnen in een cel is zeer breed.
" van tussen 10 tot 106 kopieën per cel
" het is uiteraard zeer moeilijk om laag abundante
proteïnen te detecteren
o detectiegrens van Coomassie en zilver is
weergegeven
o protein enrichment: het concentreren van
bepaalde proteïnen om ze te kunnen
analyseren en identificeren
o vaak hebben we dan heel veel cellen nodig
om deze laag abundante te detecteren
Scheiding van proteïnen
" voor analyse moet scheiding gebeuren: anders zullen analysetoestellen gesatureerd worden.
De scheiding van proteïnen gebeurt in opeenvolgende scheidingstechnieken of dimensies.
" elke dimensie is een techniek gebaseerd op verschillende fysicochemische eigenschappen
van de proteïnen of peptiden
" als je meerdere scheidingstechnieken achtereen uitvoert, worden proteïnen meer
gescheiden van elkaar en stijgt de scheidingscapaciteit of piekcapaciteit
" scheidingstechnieken/dimensies kunnen orthogonaal zijn t.o.v. elkaar: hiermee wordt
bedoeld dat ze gebaseerd zijn op totaal verschillende eigenschappen
o als ze orthogonaal zijn, dan kan je een totale piekcapaciteit berekenen volgens:
o piekcapaciteit = CS1 x CS2 x CSn-1 x CSn met CSn de piekcapaciteit voor een bepaald
chromatografisch systeem n
4
Proteomics
Proteomics is het bepalen van een complete set proteïnen die aanwezig zijn in een systeem onder
bepaalde omstandigheden.
- vroeger werd er gefocust op één proteïne: niet veel was geweten over proteïnevariëteit
o een verandering in dit ene proteïne " men verwachtte een verandering in de cel
o dit was zeer vaak niet het geval: waarom?
o er zijn tienduizenden proteïnen in een cel " vaak veranderdde er niet extreem veel
o met de technologie van vandaag: we kunnen naar grote hoeveelheden proteïnen
kijken, de proteomen, al dan niet de complete verzameling proteïnen in een cel
- bioinformatica is belangrijk: we kunnen verschillende entiteiten verwerken, expressie
bepalen en deze vergelijken en verbinden!
- systeem kan verschillen
o bv. spreken van een klein complex: associatie van minstens 2 polypeptiden
o of van een subcellulair compartiment, tot een cel tot een heel weefsel
o tot zelfs een heel organisme! (nog niet bij mensen, eerder gisten of C. elegans bv.)
- omstandigheden kunnen verschillen
o conditie van de cel: leeftijd, differentiatie, infectie, tumor
o treatment: bv. in hypoxische condities, bij virusinfectie
o tijd na treatment: 15 min? 2 uur? 3 maanden?
§ bepaling van verschillende tijdspunten: dit is belangrijk want
§ een cel is dynamisch en verandert continu: door signaalcascades (binding)
worden nieuwe proteïnen vrijgesteld en verandert het proteoom
Waarom proteomics?
Proteïnen zijn de werkpaarden van de cel die de verschillende celfuncties effectief uitvoeren.
- 1 genomics: de bibliotheek (DNA) doet op zichzelf eigenlijk niets
- genen moeten worden omgevormd tot de werkpaarden die alle processen uitvoeren
- vergelijking met een motor
o genomics vormt een lijst van alle verschillende onderdelen van de motor
o we moeten natuurlijk weten hoe deze assembleren en samen functioneren
o proteomics onderzoekt dan hoe dit gebeurt en hoe de moto uiteindelijk rijdt
Proteogenomics:
- bij genome sequencing: het is steeds moeilijk om genen te voorspellen
- een bevestiging van het genproduct door proteomische analyse is nog steeds noodzakelijk
- dit toont het belang van proteomics nog eens aan!
1
,2. Meer proteïnen per gen
Als we een vergelijking maken tussen het aantal mRNA transcripten en de eiwitten zien we weinig
correlatie tussen beide.
" in veel gevallen is er zeker een correlatie: maar niet altijd!
" als we willen kijken naar de ‘real thing’, kijken we best naar het proteïneniveau
" in de figuur rechts: veel parallelle lijnen " voor veel mRNA is er geen corresponderend eiwit!
3.1 Posttranslationele modificaties (PTM)
Na transcriptie en translatie volgen nog de
posttranslationele modificaties.
" chemische modificatie: groepen worden
toegevoegd/verwijderd (bv. adenylatie)
" zeer dynamische processen
" ook weer niet te zien bij genomics
3.2 Alternatieve splicing
Alternatieve splicing: van één pre-mRNA molecule worden verschillende
mRNA-moleculen gevormd, waardoor er verschillende proteïnen ontstaan.
" deze hebben meestal een grote homologie
" maar er zijn dan extra of verwijderde delen
" bv. α-1 antitrypsine heeft 22 verschillende isovormen
" dit is dus niet te voorspellen door genomics
4. Proteïne interactie netwerken
Een interactienetwerk is een hogere orde van complexiteit, zonder wijziging in
aantal componenten.
" ongeveer 78% van de gistproteïnen neemt deel in een complex
" meeste celprocessen zijn gereguleerd door proteïnecomplexen en niet
door individuele prot.
" functionele proteomics: de definitie van een proteïne als een element
in een interactie-netwerk (contextuele functie), eerder dan het
toeschrijven als één functie
" genomics kan de interactie met andere componenten ook niet
voorspellen
2
,5. Cellulaire lokalisatie
Een proteïne kan gelokaliseerd worden naar één of meerdere cellulaire locaties (bv. kern, cytosol, ...)
" heeft vaak verschillende bindingspartners op verschillende locaties
" een proteïne heeft hierdoor ook vaak verschillende functies, afhankelijk van zijn lokalisatie
" dit is ook weer met genomics niet te voorspellen
Proteomics als deel van systeembiologie
Systeembiologie probeert de dynamische complexiteit van een organisme te achterhalen.
Een geïntegreerd beeld van alle aspecten van proteïnen moet hiervoor ontwikkeld worden.
- mRNA en proteïne levels en hoe deze veranderen over de tijd
o bv. tijdens de ontwikkeling of tijdens pathologische condities
- kennis over de staat en eigenschappen van alle proteïnen
o posttranslationele modificatie
o cellulaire lokalisatie
o proteolytische degradatie: synthese, lokalisatie en activiteit van proteasen
o ....
- alle proteïne-proteïne interacties in zowel ruimte als tijd in één cel
" samen met genomics en metabolomics data kan dit geïntegreerd worden naar de systeembiologie
Verschillende gezichten van proteomics
Proteomics sensu strictu vormt slechts een beschrijving: een lijst van eigenschappen: so what?
Het is per definitie ‘op grote schaal de identificatie en karakterisatie van proteïnen, incl. PTM’
Differentiële proteomics is het op grote schaal vergelijken van proteïne expressieniveaus.
- bv. bij een bepaalde pathologie: het vergelijken van een gezond en ziek sample
- zien of er dan een relatie is: verschil in hoeveelheid, extra PTM, ... " dit is differentieel
Cell-mapping proteomics gaan via studies de proteïne-proteïne interacties achterhalen.
Identificatie van proteïnen
3
, Sample preparation
Sample preparation is heel erg belangrijk: “Trash comes in, trash comes out.”
- je kan heel dure machines kopen maar ze zijn onbruikbaar als je dit niet deftig doet
- het proces van sample preparation gebeurt in verschillende stappen
a. Desintegreer weefsels en cellen en extraheer de eiwitfractie.
b. Modificeer de proteïnen voor de verdere analyse.
i. bv. denaturatie, reductie, ...
ii. afhankelijk van de methoden die je gaat gebruiken tijdens separatie,
purificatie en identificatie
Een aantal variabelen bepalen het slagen van de verdere stappen:
- methoden van cellyse en het kiezen van het juiste detergent
- pH, temperatuur
- proteolytische degradatie: toevoegen van protease inhibitoren
o proteasen van ene celtype kunnen interageren met proteïnen van het andere celtype
o inhibitoren zijn nodig om deze interactie te voorkomen
Dynamische range van proteïnen in een cel is zeer breed.
" van tussen 10 tot 106 kopieën per cel
" het is uiteraard zeer moeilijk om laag abundante
proteïnen te detecteren
o detectiegrens van Coomassie en zilver is
weergegeven
o protein enrichment: het concentreren van
bepaalde proteïnen om ze te kunnen
analyseren en identificeren
o vaak hebben we dan heel veel cellen nodig
om deze laag abundante te detecteren
Scheiding van proteïnen
" voor analyse moet scheiding gebeuren: anders zullen analysetoestellen gesatureerd worden.
De scheiding van proteïnen gebeurt in opeenvolgende scheidingstechnieken of dimensies.
" elke dimensie is een techniek gebaseerd op verschillende fysicochemische eigenschappen
van de proteïnen of peptiden
" als je meerdere scheidingstechnieken achtereen uitvoert, worden proteïnen meer
gescheiden van elkaar en stijgt de scheidingscapaciteit of piekcapaciteit
" scheidingstechnieken/dimensies kunnen orthogonaal zijn t.o.v. elkaar: hiermee wordt
bedoeld dat ze gebaseerd zijn op totaal verschillende eigenschappen
o als ze orthogonaal zijn, dan kan je een totale piekcapaciteit berekenen volgens:
o piekcapaciteit = CS1 x CS2 x CSn-1 x CSn met CSn de piekcapaciteit voor een bepaald
chromatografisch systeem n
4
