Leerstof hoorcollege 1:
Genetische merkers en DNA-technieken (en merker technieken) zijn ervoor om verschillen
in genen en genexpressie in beeld te brengen. Leerstof van week 1 is een introductie voor
DNA-technieken, week 2 gaat over de genetische merker technieken.
Voorkennis:
De structuur van een DNA streng:
DNA bestaat uit strengen (de nucleïnezuren). Een nucleïnezuur is weer opgebouwd uit
nucleotiden. Elk DNA-nucleotide bestaat uit het suiker desoxyribose (blauw) die vastzit aan
een stikstofhoudende base (A, T, G of C) en een fosfaat groep (geel). Je hebt vier
verschillende soorten nucleotiden omdat er vier verschillende stikstofbasen zijn. De fosfaat
groep van een nucleotide zit vast aan de suiker van de volgende nucleotide. Dit vormt een
‘backbone’ van afwisselende fosfaten en suikers waaruit de basen uitsteken (zie twee titels
boven in het plaatje).
Een streng eindigt met een fosfaatgroep of een suikergroep (desoxyribose in DNA). Dit
betekent dat beide uiteinden verschillend zijn (5' en 3').
5’ en 3’ verwijzen naar de nummers die zijn
toegewezen aan de C-atoom van
desoxyribose (zie kleine roze cijfers bij de
desoxyribose).
Het RNA heeft de stikstofbasen uracil in
plaats van thymine. In DNA en RNA binden
Cytosine (C) en Guanine (G) altijd met
elkaar. In DNA worden waterstofbruggen
gevormd tussen Adenine (A) en Thymine (T),
in RNA bindt Adenine (A) met Uracil (U).
Basenparen regels:
Waarom A met T en G met C bindt:
A en T gaan twee waterstofbruggen aan. G
en C gaan drie waterstofbruggen aan. G en A
kunnen niet samenbinden omdat de een dus
twee waterstofbruggen aan wil gaan en de
ander drie. Een enzym kan het DNA
makkelijk ontritsen omdat deze
waterstofbruggen niet erg sterk zijn.
Mutatie:
Mutatie – Is een verandering in de nucleotidevolgorde in het DNA van een organisme of in
het DNA of RNA van een virus. Mutaties van een of meerdere nucleotiden hebben effect op
de eiwit structuur en functie. Puntmutaties zijn veranderingen in een enkel nucleotidepaar
van een gen.
,Zichtbaar maken van variatie in DNA en genexpressie kan op 3 verschillende
niveaus:
1: DNA
Door naar DNA te kijken kan je de verschillen in sequenties zien, waardoor je variatie in DNA
kan bekijken. Als we dan kijken naar het plaatje hieronder zie je dat het DNA met 1
nucleotide verschilt tussen de 2 type bloedcellen. Als we dus naar het DNA kijken zien we de
variatie in nucleotide.
2: (m)RNA
Niet elke verandering in het DNA leidt tot een verandering in de genexpressie, een
verandering in het DNA kan namelijk ook plaats vinden in de intronen, en deze worden er
natuurlijk uitgeknipt voordat er een mRNA streng van pre-mRNA wordt gemaakt. Door naar
het (m)RNA te kijken kan je bekijken wat een cel uiteindelijk als eiwit zal maken, en daarmee
dus kijken naar de genexpressie. Als we kijken naar het plaatje hieronder zie je dat hier ook
het mRNA verschilt met 1 nucleotide, waardoor je uiteindelijk wel een ander aminozuur
krijgt in het eiwit, en dus is de genexpressie anders doordat er een ander eiwit uitkomt.
3: Eiwitten
Eiwitten worden vooral gebruikt bij het zichtbaar maken van genexpressie en variatie in
DNA. Als we dan kijken naar het plaatje hieronder zien we dat de eiwitten die geproduceerd
worden er anders uitzien doordat er 1 aminozuur verschilt. Dit ene eiwit zorgt ervoor dat de
vorm van de bloedcel veranderd.
Voorbeeld puntmutatie:
De sikkelcelziekte komt door de mutatie van een enkele nucleotide paar in het gen dat voor
B globine polypeptide van hemoglobine codeert. Het allel is van de sikkel cel anders dan die
van het wild-type cel. De verandering van die enkele nucleotide in de DNA-template streng
leidt naar een veranderd mRNA en daardoor de productie van een abnormaal eiwit.
,DN1A-technieken:
Alle technieken bestaan uit meerdere stappen waar je soms alle en soms een deel van de
ondersteunende processen die hier onderin staan toepast.
- De typen PCR (qPCR, ddPCR, PCR-RFLP, allel specifieke PCR en PCR met
microsatellieten)
- RNAseq en microarray (voor genexpressie)
- DNA sequencing
Ondersteunende processen voor DNA-technieken:
Zonder deze processen kun je geen DNA-technieken uitvoeren!
In het kort een overzicht:
DNA-extractie – DNA uit een cel halen.
DNA-restrictie – DNA op een specifieke plek knippen.
DNA-ligatie – 2 strengen DNA aan elkaar plakken.
DNA-hybridisatie – 2 complementaire strengen enkelstrengs DNA of RNA komen samen en
vormen waterstofbruggen om een dubbelstrengs molecuul te vormen.
DNA-replicatie of -amplificatie – Het vermeerderen van het DNA. Replicatie is in principe 1x
vermeerderen, amplificatie is het heel vaak repliceren van DNA, waardoor je dus veel DNA
krijgt.
DNA-visualisatie – DNA visueel maken, dus een handeling zodat DNA visueel gepresenteerd
kan worden.
DNA-extractie
Genetische merker technieken aan de hand van DNA beginnen met DNA-extractie.
DNA-extractie – is een methode om DNA te zuiveren door fysieke en/of chemische
methoden toe te passen waarbij DNA wordt gescheiden van celmembranen, eiwitten
(histonen, DNAses) en andere cellulaire componenten.
Het heet ook wel extraheren.
Er zijn verschillende methoden om DNA te extraheren. Maar bij elke methode heb je
minimaal 3 stappen:
1. Het celmembraan opbreken (bij planten en schimmels moet ook de celwanden kapot
gemaakt worden). Kan bijvoorbeeld gedaan worden door weefsel fijn te malen of
een soort zeep toe te voegen.
2. Eiwitten verwijderen (bijna altijd nodig). Bepaalde eiwitten maken het DNA kapot als
de cel wordt afgebroken, die eiwitten moeten dus eerst kapot gemaakt worden
(door een enzym genaamd protease) voordat we het DNA eruit halen.
3. DNA uit de oplossing halen. IJskoud alcohol laat het DNA neerslaan, waardoor het na
een centrifuge of met een pipet uit de oplossing gehaald kan worden.
Variaties in methode zijn mogelijk, afhankelijk van welke DNA-bron gebruikt wordt.
In een plant heb je bijvoorbeeld 3 verschillende bronnen waar je DNA van kan halen, dit zijn
de celkernen, mitochondriën en chloroplasten.
, Er zijn drie DNA-bronnen mogelijk in een eukaryoten cel:
- De kern
- Chloroplast (alleen bij plantencel)
- Mitochondriën
DNA-restrictie
DNA-restrictie – DNA in kleinere fragmenten knippen met behulp van restrictie-enzymen.
Bij DNA-restrictie wordt gebruik gemaakt van restrictie-enzymen. Restrictie-enzymen – Een
enzym dat erg specifiek is, ze herkennen een specifieke nucleotidevolgorde (restrictiesites)
en knippen beide DNA strengen op specifieke plekken in de restrictiesite.
Restrictiesites – Een specifieke volgorde in een DNA streng die herkend en opgeknipt wordt
door een restrictie-enzym. De meeste restrictie sites zijn symmetrisch. Dit houdt in dat de
sequentie van nucleotiden hetzelfde is op beide strengen als je het in de 5’ -> 3’ richting
leest.
Het meest voorkomende restrictie-enzym herkent sequenties die 4 tot 8 nucleotiden paren
bevat. Omdat elke sequentie die zo kort is vaak voorkomt in een lange DNA-molecuul, zal
een restrictie-enzym heel veel ‘cuts’ maken in zo’n DNA-molecuul, dit levert een set van
restrictiefragmenten op. Restrictiefragment – Een DNA segment dat het resultaat is van het
opknippen van DNA door een restrictie-enzym. Omdat restrictie-enzymen altijd op precies
dezelfde DNA-sequentie knippen, zullen kopieën van elk willekeurige DNA-molecuul die
blootgesteld wordt aan dezelfde restrictie-enzym altijd dezelfde set restrictiefragmenten
opleveren.
Genetische merkers en DNA-technieken (en merker technieken) zijn ervoor om verschillen
in genen en genexpressie in beeld te brengen. Leerstof van week 1 is een introductie voor
DNA-technieken, week 2 gaat over de genetische merker technieken.
Voorkennis:
De structuur van een DNA streng:
DNA bestaat uit strengen (de nucleïnezuren). Een nucleïnezuur is weer opgebouwd uit
nucleotiden. Elk DNA-nucleotide bestaat uit het suiker desoxyribose (blauw) die vastzit aan
een stikstofhoudende base (A, T, G of C) en een fosfaat groep (geel). Je hebt vier
verschillende soorten nucleotiden omdat er vier verschillende stikstofbasen zijn. De fosfaat
groep van een nucleotide zit vast aan de suiker van de volgende nucleotide. Dit vormt een
‘backbone’ van afwisselende fosfaten en suikers waaruit de basen uitsteken (zie twee titels
boven in het plaatje).
Een streng eindigt met een fosfaatgroep of een suikergroep (desoxyribose in DNA). Dit
betekent dat beide uiteinden verschillend zijn (5' en 3').
5’ en 3’ verwijzen naar de nummers die zijn
toegewezen aan de C-atoom van
desoxyribose (zie kleine roze cijfers bij de
desoxyribose).
Het RNA heeft de stikstofbasen uracil in
plaats van thymine. In DNA en RNA binden
Cytosine (C) en Guanine (G) altijd met
elkaar. In DNA worden waterstofbruggen
gevormd tussen Adenine (A) en Thymine (T),
in RNA bindt Adenine (A) met Uracil (U).
Basenparen regels:
Waarom A met T en G met C bindt:
A en T gaan twee waterstofbruggen aan. G
en C gaan drie waterstofbruggen aan. G en A
kunnen niet samenbinden omdat de een dus
twee waterstofbruggen aan wil gaan en de
ander drie. Een enzym kan het DNA
makkelijk ontritsen omdat deze
waterstofbruggen niet erg sterk zijn.
Mutatie:
Mutatie – Is een verandering in de nucleotidevolgorde in het DNA van een organisme of in
het DNA of RNA van een virus. Mutaties van een of meerdere nucleotiden hebben effect op
de eiwit structuur en functie. Puntmutaties zijn veranderingen in een enkel nucleotidepaar
van een gen.
,Zichtbaar maken van variatie in DNA en genexpressie kan op 3 verschillende
niveaus:
1: DNA
Door naar DNA te kijken kan je de verschillen in sequenties zien, waardoor je variatie in DNA
kan bekijken. Als we dan kijken naar het plaatje hieronder zie je dat het DNA met 1
nucleotide verschilt tussen de 2 type bloedcellen. Als we dus naar het DNA kijken zien we de
variatie in nucleotide.
2: (m)RNA
Niet elke verandering in het DNA leidt tot een verandering in de genexpressie, een
verandering in het DNA kan namelijk ook plaats vinden in de intronen, en deze worden er
natuurlijk uitgeknipt voordat er een mRNA streng van pre-mRNA wordt gemaakt. Door naar
het (m)RNA te kijken kan je bekijken wat een cel uiteindelijk als eiwit zal maken, en daarmee
dus kijken naar de genexpressie. Als we kijken naar het plaatje hieronder zie je dat hier ook
het mRNA verschilt met 1 nucleotide, waardoor je uiteindelijk wel een ander aminozuur
krijgt in het eiwit, en dus is de genexpressie anders doordat er een ander eiwit uitkomt.
3: Eiwitten
Eiwitten worden vooral gebruikt bij het zichtbaar maken van genexpressie en variatie in
DNA. Als we dan kijken naar het plaatje hieronder zien we dat de eiwitten die geproduceerd
worden er anders uitzien doordat er 1 aminozuur verschilt. Dit ene eiwit zorgt ervoor dat de
vorm van de bloedcel veranderd.
Voorbeeld puntmutatie:
De sikkelcelziekte komt door de mutatie van een enkele nucleotide paar in het gen dat voor
B globine polypeptide van hemoglobine codeert. Het allel is van de sikkel cel anders dan die
van het wild-type cel. De verandering van die enkele nucleotide in de DNA-template streng
leidt naar een veranderd mRNA en daardoor de productie van een abnormaal eiwit.
,DN1A-technieken:
Alle technieken bestaan uit meerdere stappen waar je soms alle en soms een deel van de
ondersteunende processen die hier onderin staan toepast.
- De typen PCR (qPCR, ddPCR, PCR-RFLP, allel specifieke PCR en PCR met
microsatellieten)
- RNAseq en microarray (voor genexpressie)
- DNA sequencing
Ondersteunende processen voor DNA-technieken:
Zonder deze processen kun je geen DNA-technieken uitvoeren!
In het kort een overzicht:
DNA-extractie – DNA uit een cel halen.
DNA-restrictie – DNA op een specifieke plek knippen.
DNA-ligatie – 2 strengen DNA aan elkaar plakken.
DNA-hybridisatie – 2 complementaire strengen enkelstrengs DNA of RNA komen samen en
vormen waterstofbruggen om een dubbelstrengs molecuul te vormen.
DNA-replicatie of -amplificatie – Het vermeerderen van het DNA. Replicatie is in principe 1x
vermeerderen, amplificatie is het heel vaak repliceren van DNA, waardoor je dus veel DNA
krijgt.
DNA-visualisatie – DNA visueel maken, dus een handeling zodat DNA visueel gepresenteerd
kan worden.
DNA-extractie
Genetische merker technieken aan de hand van DNA beginnen met DNA-extractie.
DNA-extractie – is een methode om DNA te zuiveren door fysieke en/of chemische
methoden toe te passen waarbij DNA wordt gescheiden van celmembranen, eiwitten
(histonen, DNAses) en andere cellulaire componenten.
Het heet ook wel extraheren.
Er zijn verschillende methoden om DNA te extraheren. Maar bij elke methode heb je
minimaal 3 stappen:
1. Het celmembraan opbreken (bij planten en schimmels moet ook de celwanden kapot
gemaakt worden). Kan bijvoorbeeld gedaan worden door weefsel fijn te malen of
een soort zeep toe te voegen.
2. Eiwitten verwijderen (bijna altijd nodig). Bepaalde eiwitten maken het DNA kapot als
de cel wordt afgebroken, die eiwitten moeten dus eerst kapot gemaakt worden
(door een enzym genaamd protease) voordat we het DNA eruit halen.
3. DNA uit de oplossing halen. IJskoud alcohol laat het DNA neerslaan, waardoor het na
een centrifuge of met een pipet uit de oplossing gehaald kan worden.
Variaties in methode zijn mogelijk, afhankelijk van welke DNA-bron gebruikt wordt.
In een plant heb je bijvoorbeeld 3 verschillende bronnen waar je DNA van kan halen, dit zijn
de celkernen, mitochondriën en chloroplasten.
, Er zijn drie DNA-bronnen mogelijk in een eukaryoten cel:
- De kern
- Chloroplast (alleen bij plantencel)
- Mitochondriën
DNA-restrictie
DNA-restrictie – DNA in kleinere fragmenten knippen met behulp van restrictie-enzymen.
Bij DNA-restrictie wordt gebruik gemaakt van restrictie-enzymen. Restrictie-enzymen – Een
enzym dat erg specifiek is, ze herkennen een specifieke nucleotidevolgorde (restrictiesites)
en knippen beide DNA strengen op specifieke plekken in de restrictiesite.
Restrictiesites – Een specifieke volgorde in een DNA streng die herkend en opgeknipt wordt
door een restrictie-enzym. De meeste restrictie sites zijn symmetrisch. Dit houdt in dat de
sequentie van nucleotiden hetzelfde is op beide strengen als je het in de 5’ -> 3’ richting
leest.
Het meest voorkomende restrictie-enzym herkent sequenties die 4 tot 8 nucleotiden paren
bevat. Omdat elke sequentie die zo kort is vaak voorkomt in een lange DNA-molecuul, zal
een restrictie-enzym heel veel ‘cuts’ maken in zo’n DNA-molecuul, dit levert een set van
restrictiefragmenten op. Restrictiefragment – Een DNA segment dat het resultaat is van het
opknippen van DNA door een restrictie-enzym. Omdat restrictie-enzymen altijd op precies
dezelfde DNA-sequentie knippen, zullen kopieën van elk willekeurige DNA-molecuul die
blootgesteld wordt aan dezelfde restrictie-enzym altijd dezelfde set restrictiefragmenten
opleveren.
