TÉCNICA
HISTOLÓGICA Y
MICROSCOPIA
MICROSCOPIA
1. OCULARES: puede tener un solo ocular (monocular), dos (binocular), tres (triocular). Si es
10X indica que la amplificación final de la imagen es 10 veces mayor a la obtenida por el
objetivo.
2. TUBO
3. OBJETIVOS: hay 4X (en rojo), 10X (en amarillo), 40X (en azul), 100X (en blanco o negro),
éste último se utiliza con aceite de inmersión.
4. PLATINA: sostiene el preparado.
5. CONDENSADOR: concentra el rayo de luz sobre el preparado.
6. TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR: baja o sube el condensador.
7. TORNILLO MACRO Y MICROMÉTRICO: mueven la platina de derecha a izquierda, de adelante
hacia atrás.
8. DIAFRAGMA DE CAMPO LUMINOSO
9. PIE
ERRORES Y POSIBLES CORRECCIONES
Si el preparado está borroso puede ser porque la lente está sucia o el preparado está sucio. En el
primer caso, se limpia el lente con papel de lentes o similar. En el segundo caso, limpiar el
cubreobjetos con papel de lente y evitar apoyar los dedos sobre él. Si no hay luz; verificar que el
microscopio esté enchufado correctamente, verificar la posición de la perilla de encendido,
verificar la apertura del condensador y su altura.
TECNICA
HISTOLOGICA
OBTENCION DEL MATERIAL
FORMA DE OBTENCIÓN: La pieza se obtiene por biopsia autopsia, sacrificando un animal
(cloroformo, éter, etc.).
TAMAÑO DE LAS PIEZAS: conviene fijar piezas pequeñas, que no excedan los 0,5 a 1 cm3 de
espesor.
VOLUMEN DEL FIJADOR: Debe ser 40 a 50 veces mayor que el de las piezas de material
obtenidas.
,FIJACION
Es un método destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica
y química de las células y tejidos al estado vivo, y que permite realizar posteriormente coloración.
Clasificación:
FIJADORES QUÍMICOS: pueden simples y mezclas.
O SIMPLES:
Formol 10%
Alcohol etílico absoluto o al 96°
Alcohol metílico
Ácido ósmico (tetróxido de osmio)
Bicloruro de mercurio
O COMPUESTOS:
Líquido de Flemming
Líquido de Zenker
Líquido de Helly
Líquido de Bouin
Líquido de Dubosq-Brasil
Ácido acético:
FIJADORES FÍSICOS: frío, cortes por congelación y desecación.
LAVADO
Cuando se cumplió el tiempo dentro del fijador, se retiran las piezas y se procede al lavado para
eliminar los restos del fijador y frenar el proceso de fijación. Las piezas fijadas en líquido a base de
bicromatos y bicloruros de Hg deben ser lavadas en agua corriente de 12-24hs., las fijadas a base
de ácido pícrico no deben lavarse.
DESHIDRATACIÓN
Las piezas retiradas del fijador se encuentran embebidas en agua. El
H2O impide la penetración de la parafina, y es necesario retirar el
agua a los tejidos. La deshidratación se obtiene sumergiendo las
piezas en alcohol etílico de graduación creciente:
ACLARACION
Paso intermedio entre el alcohol y la parafina, debido a que el alcohol no es solvente de la
parafina, y se debe usar solventes como: xilol. Se hace un
pasaje gradual:
INCLUSIÓN EN PARAFINA
PENETRACIÓN. Se sumergen las piezas en la parafina a 52 - 56 ° de punto de fusión.
INCLUSIÓN DEFINITIVA. En moldes de papel o de metal se vierte parafina fundida.
Se colocan las piezas orientándolas y se sumerge el molde parcialmente en agua para que en 15 a
30 minutos la parafina se solidifique completamente.
MONTAJE EN EL TACO
El bloque de parafina se coloca sobre un taco de madera o metal y se lo pega al mismo. La función
del taco es poder sostener al bloque para que pueda ser cortado.
, CORTES
Para los cortes se usa un micrótomo que permite hacer cortes con una graduación milimétrica que
uno puede definir. En microscopía óptica los cortes no deben exceder de 5 a 8 micrómetros de
espesor.
MONTAJE EN EL PORTAOBJETOS
Se realiza la extensión y adhesión de los cortes sobre el vidrio del portaobjeto. Hay dos formas:
Se pueden colocar los cortes en agua caliente a 40 o 45°, luego recogerlos con la ayuda de
una aguja colocándolos sobre el portaobjetos que previamente debe ser limpiado y en los
que se colocó una gota de albúmina de Mayer. Posteriormente inclinar el portaobjetos para
que escurra el líquido, secar el excedente con una gasa y colocarlo sobre la llama de una
lámpara de alcohol, dejarlo 1 a 2 horas en la estufa a 40 a 45°C.
Se realiza colocando los cortes sobre el portaobjetos en el cual se ha depositado una gota
de albúmina diluida para luego flamearlo sobre la llama del mechero, el resto sigue como el
procedimiento anterior.
Albúmina de Mayer: mezcla de partes iguales de clara de huevo y glicerina, se prepara
midiendo la cantidad de clara de huevo y batiéndola a punto nieve y luego añadir la misma
cantidad de glicerina, se filtra y se agrega un cristal de timol como preservador. Este preparado
sirve para pegar el corte al portaobjetos.
DESPARAFINIZACIÓN
Como la parafina impide la coloración, corresponde eliminarla. Se utiliza uno de los disolventes de
la misma: xilol, toluol, benzol, etc. Todos estos procedimientos se realizan en una grilla de frascos
especiales de coloración donde se introducen los preparados en xilol 1 a 2 minutos en dos
cambios hasta que el preparado se vuelve transparente. Luego se introduce el preparado en
alcohol 100% durante 30 segundos a 1 minuto para eliminar el xilol empleado. En ese momento el
preparado se vuelve opaco y permite comprobar si la parafina se ha eliminado completamente; de
no ser así, se repite el baño en xilol.
REHIDRATACIÓN
Como los cortes están completamente deshidratados y vamos a emplear un colorante
en solución acuosa, corresponde hidratarlos previamente. Se emplea la serie de alcohol de
diferente graduación, pero esta vez en graduación decreciente.
COLORACIÓN
Clasificación de los colorantes:
Colorantes naturales:
o Animales: Carmín.
o Vegetales: Hematoxilina, orceína, azafrán.
Colorantes artificiales:
o Ácidos: Sales cuya base es incolora y el ácido coloreado (eosina). Son colorantes
citoplasmáticos.
o Básicos: Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o
clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
o Neutros: Sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados (eosinato de
azul de metileno). Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
HISTOLÓGICA Y
MICROSCOPIA
MICROSCOPIA
1. OCULARES: puede tener un solo ocular (monocular), dos (binocular), tres (triocular). Si es
10X indica que la amplificación final de la imagen es 10 veces mayor a la obtenida por el
objetivo.
2. TUBO
3. OBJETIVOS: hay 4X (en rojo), 10X (en amarillo), 40X (en azul), 100X (en blanco o negro),
éste último se utiliza con aceite de inmersión.
4. PLATINA: sostiene el preparado.
5. CONDENSADOR: concentra el rayo de luz sobre el preparado.
6. TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR: baja o sube el condensador.
7. TORNILLO MACRO Y MICROMÉTRICO: mueven la platina de derecha a izquierda, de adelante
hacia atrás.
8. DIAFRAGMA DE CAMPO LUMINOSO
9. PIE
ERRORES Y POSIBLES CORRECCIONES
Si el preparado está borroso puede ser porque la lente está sucia o el preparado está sucio. En el
primer caso, se limpia el lente con papel de lentes o similar. En el segundo caso, limpiar el
cubreobjetos con papel de lente y evitar apoyar los dedos sobre él. Si no hay luz; verificar que el
microscopio esté enchufado correctamente, verificar la posición de la perilla de encendido,
verificar la apertura del condensador y su altura.
TECNICA
HISTOLOGICA
OBTENCION DEL MATERIAL
FORMA DE OBTENCIÓN: La pieza se obtiene por biopsia autopsia, sacrificando un animal
(cloroformo, éter, etc.).
TAMAÑO DE LAS PIEZAS: conviene fijar piezas pequeñas, que no excedan los 0,5 a 1 cm3 de
espesor.
VOLUMEN DEL FIJADOR: Debe ser 40 a 50 veces mayor que el de las piezas de material
obtenidas.
,FIJACION
Es un método destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica
y química de las células y tejidos al estado vivo, y que permite realizar posteriormente coloración.
Clasificación:
FIJADORES QUÍMICOS: pueden simples y mezclas.
O SIMPLES:
Formol 10%
Alcohol etílico absoluto o al 96°
Alcohol metílico
Ácido ósmico (tetróxido de osmio)
Bicloruro de mercurio
O COMPUESTOS:
Líquido de Flemming
Líquido de Zenker
Líquido de Helly
Líquido de Bouin
Líquido de Dubosq-Brasil
Ácido acético:
FIJADORES FÍSICOS: frío, cortes por congelación y desecación.
LAVADO
Cuando se cumplió el tiempo dentro del fijador, se retiran las piezas y se procede al lavado para
eliminar los restos del fijador y frenar el proceso de fijación. Las piezas fijadas en líquido a base de
bicromatos y bicloruros de Hg deben ser lavadas en agua corriente de 12-24hs., las fijadas a base
de ácido pícrico no deben lavarse.
DESHIDRATACIÓN
Las piezas retiradas del fijador se encuentran embebidas en agua. El
H2O impide la penetración de la parafina, y es necesario retirar el
agua a los tejidos. La deshidratación se obtiene sumergiendo las
piezas en alcohol etílico de graduación creciente:
ACLARACION
Paso intermedio entre el alcohol y la parafina, debido a que el alcohol no es solvente de la
parafina, y se debe usar solventes como: xilol. Se hace un
pasaje gradual:
INCLUSIÓN EN PARAFINA
PENETRACIÓN. Se sumergen las piezas en la parafina a 52 - 56 ° de punto de fusión.
INCLUSIÓN DEFINITIVA. En moldes de papel o de metal se vierte parafina fundida.
Se colocan las piezas orientándolas y se sumerge el molde parcialmente en agua para que en 15 a
30 minutos la parafina se solidifique completamente.
MONTAJE EN EL TACO
El bloque de parafina se coloca sobre un taco de madera o metal y se lo pega al mismo. La función
del taco es poder sostener al bloque para que pueda ser cortado.
, CORTES
Para los cortes se usa un micrótomo que permite hacer cortes con una graduación milimétrica que
uno puede definir. En microscopía óptica los cortes no deben exceder de 5 a 8 micrómetros de
espesor.
MONTAJE EN EL PORTAOBJETOS
Se realiza la extensión y adhesión de los cortes sobre el vidrio del portaobjeto. Hay dos formas:
Se pueden colocar los cortes en agua caliente a 40 o 45°, luego recogerlos con la ayuda de
una aguja colocándolos sobre el portaobjetos que previamente debe ser limpiado y en los
que se colocó una gota de albúmina de Mayer. Posteriormente inclinar el portaobjetos para
que escurra el líquido, secar el excedente con una gasa y colocarlo sobre la llama de una
lámpara de alcohol, dejarlo 1 a 2 horas en la estufa a 40 a 45°C.
Se realiza colocando los cortes sobre el portaobjetos en el cual se ha depositado una gota
de albúmina diluida para luego flamearlo sobre la llama del mechero, el resto sigue como el
procedimiento anterior.
Albúmina de Mayer: mezcla de partes iguales de clara de huevo y glicerina, se prepara
midiendo la cantidad de clara de huevo y batiéndola a punto nieve y luego añadir la misma
cantidad de glicerina, se filtra y se agrega un cristal de timol como preservador. Este preparado
sirve para pegar el corte al portaobjetos.
DESPARAFINIZACIÓN
Como la parafina impide la coloración, corresponde eliminarla. Se utiliza uno de los disolventes de
la misma: xilol, toluol, benzol, etc. Todos estos procedimientos se realizan en una grilla de frascos
especiales de coloración donde se introducen los preparados en xilol 1 a 2 minutos en dos
cambios hasta que el preparado se vuelve transparente. Luego se introduce el preparado en
alcohol 100% durante 30 segundos a 1 minuto para eliminar el xilol empleado. En ese momento el
preparado se vuelve opaco y permite comprobar si la parafina se ha eliminado completamente; de
no ser así, se repite el baño en xilol.
REHIDRATACIÓN
Como los cortes están completamente deshidratados y vamos a emplear un colorante
en solución acuosa, corresponde hidratarlos previamente. Se emplea la serie de alcohol de
diferente graduación, pero esta vez en graduación decreciente.
COLORACIÓN
Clasificación de los colorantes:
Colorantes naturales:
o Animales: Carmín.
o Vegetales: Hematoxilina, orceína, azafrán.
Colorantes artificiales:
o Ácidos: Sales cuya base es incolora y el ácido coloreado (eosina). Son colorantes
citoplasmáticos.
o Básicos: Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o
clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
o Neutros: Sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados (eosinato de
azul de metileno). Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
