HC 1 - Recombinant DNA
- Biologische geneesmiddelen: eiwitten die te groot zijn om te synthetiseren. Het zijn hele grote eiwit
geneesmiddelen.
- Ribosoom: van bacteriën of eukaryoten krijgen een stappenplan om eiwitten te produceren. Er wordt DNA
toegediend, Recombinant DNA.
- Recombinant DNA: instructie voor het produceren van een bepaald eiwit dat misschien niet in het organisme zelf
hoort, maar door dit DNA wel toe wordt aangezet.
- Proces: klonen van Recombinante DNA, eiwitproductie, purificatie en formulering voor opslag.
- Cellen: worden gebruikt om het te produceren.
Kloning middels bacterie: Circulair DNA wordt in een plasmide geplaatst, hier zit een promotor in (kies er
een die altijd aan staat voor efficiëntste productie), een gen van interesse en een resistentiegen tegen
antibiotica in. Hiermee kun je controleren welke bacterie het opneemt en welke niet.
mRNA: wordt uit een cel gehaald die dit gen wel bevat. Voor het Recombinante gen kun je een mRNA maken
die werkt en die terug synthetiseren naar cDNA, aangezien er alleen DNA in de plasmide kan. Dit gebeurt
middels een reverse transcriptase. Daarna wordt het geamplificeerd met PCR. Dan heb je alleen nog maar de
coderende sequentie. Er worden restrictie-enzymen gebruikt om het DNA goed te knippen en plakken in de
vector (plasmide). Ligasen zorgen ervoor dat het DNA covalent wordt gebonden aan de vector.
WC 1 - Pharmaceutical Biotechnology & Recombinant DNA Technology
1.3 History of Pharmaceutical Biotechnology
Introduction to Pharmaceutical Biotechnology
Biotechnologie: het gebruik van biologische processen, levende cellen of organismen om producten te maken
die nuttig zijn voor de mensheid.
- Groene biotechnologie: agricultureel.
- Witte biotechnologie: industrieel.
- Rode biotechnologie: medisch.
- Blauwe biotechnologie: aquatisch.
Farmaceutische biotechnologie: het gebruik van biologische processen, levende cellen of organismen om
therapeutische of diagnostische producten te produceren.
Eerst werd het gedaan door stoffen te isoleren uit levende dieren maar dat kan gecontamineerd zijn. Dit leidde tot
de uitvinding van recombinant DNA techniek in de 1970s. Het werd mogelijk om ieder eiwit te produceren middels
levende cellen.
Recombinant human insulin werd in 1982 uitgevonden en in bacteriën gestopt om op grote schaal pure insuline
te produceren. Insuline was de eerste structuur die op deze manier geproduceerd werd.
Biopharmaceuticals: farmaceutische geneesmiddelproducten die geproduceerd worden in, geïsoleerd worden
uit of semi gesynthetiseerd worden uit levende systemen zoals cellen of organismen. Ze zijn zeer groot en
gecompliceerd, in tegenstelling tot normale kleine molecuul geneesmiddelen. Ze kunnen worden onderverdeeld in
8 klassen:
1. Groei factoren en cytokines.
2. Hormonen.
3. Coagulatie factoren.
4. Antitrombose factoren.
5. Therapeutische antilichamen (grootste klasse).
6. Therapeutische enzymen.
7. Vaccins.
8. Nucleotidezuur gebaseerde geneesmiddelen.
1.4 The Making of Protein Therapies
Sanofi Genzyme
Veel ziektes worden geoorzaakt door missende of kapotte enzymen.
Genzyme: een methode die mammalian cellen modificeert door er een stukje menselijk DNA aan toe te voegen,
zodat ze therapeutische eiwitten kunnen produceren. De geproduceerde eiwitten kunnen gebruikt worden als
targeted behandelingen of ter vervanging van missende of kapotte enzymen.
Cell bank: De geproduceerde cellen worden gegroeid en zorgvuldig bevroren in stikstof, voor toekomstig gebruik.
Dit vormt een opslag.
Er worden cellen uit de cell bank genomen en in een reactor geplaatst met groeimedium, waardoor de cellen zich
gaan vermeerderen. Over tijd worden ze naar een steeds grotere bioreactor verplaatst om zo steeds meer ruimte
te creëren voor nieuwe cellen. Als er voldoende cellen zijn geproduceerd worden ze in een medium geplaatst dat
ervoor zorgt dat ze het te verkrijgen eiwit gaan produceren. Wanneer er voldoende is geproduceerd wordt het
mengsel in de reactor gezuiverd van alles behalve het eiwit, zodat je alleen eiwit overhoudt. Dit wordt daarna
verpakt en zorgvuldig gecontroleerd en verzonden naar patiënten.
,1. Wat zijn de grootste verschillen tussen kleine molecuul geneesmiddelen en biopharmaceuticals?
Karakteristieken Kleine moleculen Biopharmaceuticals
Soort moleculen Relatief simpele chemische moleculen Complexe macromoleculen
Herkomst Ontdekking door libraryscreening Biologisch bestaan
Kosten Vaak goedkoop om te produceren Vaak duur om te produceren
Species Geen speciesbeperkingen Species specifiek
Activity Actief intra- en extracellulair Meestal extracellulair actief
Delivery Orale en parenterale delivery Niet oraal acties, gaan niet door BBB
Bijwerkingen/toxiciteit Bijwerkingen en toxiciteit komt voor Toxiciteit komt minder vaak voor
Eliminatie Snelle eliminatie Eliminatie is afhankelijk van BP
2. Waarom spreken we over biosimilars en niet biogenerics?
- We spreken van biosimilars in plaats van generieke geneesmiddelen, aangezien kopieën van biologische
geneesmiddelen niet altijd identiek zijn aan het oorspronkelijke geneesmiddel vanwege de complexiteit van de
actieve geneesmiddelsubstanties (de eiwitten of nucleïnezuren) en de manier waarop ze worden
geproduceerd. Verschillen in het productieproces kunnen leiden tot subtiele verschillen in de 3D-structuur en /
of posttranslationele modificaties van een eiwit die kunnen bijdragen aan een ander farmacokintetisch of
farmacodynamisch profiel.
1.5 Oefeningen - DNA, RNA en eiwitten
1. Hieronder staat het begin van de dubbelstrengse DNA sequentie van een gen (intron in kleine letters, exon in
hoofdletters, het startcon is onderstreept).
5’....caggcgcCGGAGGACTAGCCTGGGGTCACAGGGATGCCGCGGCTCCTCCGCTTGTCCCTGCTGT...
3’....gtccgcgGCCTCCTGATCGGACCCCAGTGTCCCTACGGCGCCGAGGAGGCGAACAGGGACGACA...
a. Wat is het verschil tussen de template strand en coding strand van het DNA? Welke kant zal worden
gekopieerd door RNA polymerase II?
- Een template streng is complementair aan een coderende streng. Omdat een RNA polymerase II een
streng kopieert, complementair aan de streng waar die aan vast zit (template streng), zal de nieuwe
streng gelijk zijn in nucleotidesequentie aan de coderende streng. Vandaar de naam ook, de coderende
streng codeert de sequentie van de nieuwe streng en de templatestreng is de houvast waar de
complementaire streng aan vast wordt gesynthetiseerd.
b. Beredeneer hoe de mRNA sequentie en de eiwit sequentie er uit zullen zien (gebruik hiervoor onderstaande
codon tabel).
- Een RNA polymerase II gaat altijd van de 3’ naar 5’ kant van de template streng. In dit geval wordt er dan
eerst het startcodon gesynthetiseerd en daarna wordt de sequentie van de nieuwe streng gelijk aan het
blauwe deel van de 5’ streng (coderende streng). Daarnaast moet er rekening gehouden worden met dat
A niet aan Thymine bindt maar aan Uracil.
- De aminozuursequentie wordt dan: AUGCCGCGGCUCCUCCGCUUGUCCCUGCUGU…
- MPRLLRLFSLL… wordt de eiwitsequentie. Er is nog geen stopcodon tegengekomen dus het echte eiwit
is waarschijnlijk langer.
2. Een DNA sequentie bestaat uit een herhaling van vier letters (basen).
a. Geef de structuur van deze vier basen en laat zien hoe de basenparing ontstaat.
b. Welk basenpaar bindt sterker?
- De binding tussen Cytosine (C) en Guanine (G) is het sterkst omdat hiertussen 3 waterstofbruggen
vormen terwijl de binding tussen Thymine (T) en Adenine (A) er maar twee vormt.
3. Wat is het verschil in structuur tussen DNA en RNA?
- DNA: bevat een 2-Deoxyribose en de nucleotiden adenine, cytosine, guanine en thymine. Daarnaast komt het
dubbelstrengs voor.
, - RNA: bevat een ribose en de nucleotiden adenine, cytosine, guanine en uracil in plaats van thymine.
Daarnaast komt het enkelstrengs voor.
4. Onderstaande processen vinden plaats in een eukaryote cel.
a. Geef van elk proces aan in welk subcellulair compartiment deze plaatsvindt.
Proces Locatie
RNA synthese Nucleus.
Eiwit synthese Ribosoom.
Eiwit glycolysering Endoplasmatisch reticulum en Golgi lichaam.
RNA splicing Nucleus.
b. Hoe verschilt dit van een prokaryotische cel?
- Een prokariotische cel heeft geen celkern en de RNA en eiwit synthese vinden beiden (gelijktijdig) in het
cytoplasma van de cel plaats, er is geen splicing. Glycosilering is beperkt en vind voornamelijk plaats aan
de buitenkant van het plasma membraan (in het periplasma).
5. Wat is de functie van een promotor? Waar wordt hij normaal gevonden in de sequentie, upstream of downstream
van het gen?
- Promotor: De promotorsequentie is een
DNA sequentie, die bepaalt waar
transcriptie van een gen door RNA-
polymerase begint. De promotor ligt
direct upstream (vlak voor) het af te
lezen gen. RNA-polymerase en de
benodigde transcriptiefactoren kunnen
binden aan de promotorsequentie en
transcriptie starten.
- Upstream: van de 3’ naar 5’ kant van het RNA molecuul.
- Downstream: van de 5’ naar 3’ kant van het RNA molecuul.
6. Geef van de onderstaande RNA’s aan wat hun functie in de cel is:
- mRNA (messengerRNA): wordt gevormd uit de transcriptie van DNA tot pre-mRNA dat daarna RNA-splicing
ondergaat tot mRNA en daarna translatie ondergaat naar een eiwit.
DNA → transcriptie → pre-mRNA →RNA-splicing → mRNA → translatie → eiwit.
- Ribosomaal RNA: onderdeel van het ribosoom dat als functie heeft om de reactie die de eiwitketen verlengt
te katalyseren. Belangrijk voor de structuur/functie van het ribosoom (ribosoom bestaat voor 60% uit rRNA en
40% protein uit eiwit)
- MicroRNA: een vorm van niet-coderend RNA van 20 tot 25 nucleotiden lang en is onderdeel van de
epigenetische mechanismen die de expressie van genen reguleren. Het is complementair aan een stukje
sequentie van één of meerdere mRNA’s in het gebied 3’ UTR. Door op deze plaats een dubbele streng met
het mRNA te vormen wordt de translatie van het mRNA tegengehouden. 3’ UTR is alles wat na het stopcodon
zit.
- tRNA (transfer-RNA): een molecuul dat bindt aan codons op een mRNA middels zijn anticodon en bindt het
het aminozuur dat erbij hoort vast aan de al bestaande aminozuurketen, zo plakt het telkens aminozuren aan
het vormende eiwit, volgens de nucleotidesequentie.
7. N-linked glycolysering is belangrijk voor de functie van eiwitten.
a. In welk compartiment vindt N-linked glycolysering van eiwitten plaats?
- N-linked glycolysation: is de aanhechting van een oligosaccharide, een koolhydraat bestaande uit
verschillende suikermoleculen, soms ook wel glycaan genoemd, aan een stikstofatoom (de amidestikstof
van een asparagine overblijfsel van een eiwit. Dit proces gebeurt in het golgi lichaam en het
endoplasmatische reticulum.
b. Wat is het effect van deze posttranslationele modificatie op de stabiliteit en oplosbaarheid van een eiwit?
- Functies van N-linked glycanenL
Intrinstiek 1. Zorgt voor structurele componenten voor de celwand en extracellulaire matrix.
2. Modificeert eiwiteigeinschappen zoals stabiliteit en oplosbaarheid.
Extrinstiek 1. Leidt het verplaatsen van glycoproteïnen.
2. Medieert cel signalering.
c. Waarom is het belangrijk om te weten dat N-linked glycolysering van organisme tot organisme verschilt?
- Verschillende species synthetiseren verschillende types van N-linked glycaan. Hiermee moet je rekening
houden omdat het de vouwing van een eiwit beïnvloedt.
- Therapeutische eiwitten die gemaakt zijn in een andere soort kunnen afwijkende glycolysering hebben
wat van invloed kan zijn op de functie en herkenning door het immuunsysteem (afweerreactie tegen het
eiwit).
- Glycanen kunnen ook betrokken zijn bij 'zelf'- en' niet-zelf'-discriminatie, wat relevant kan zijn voor de
pathofysiologie van verschillende auto-immuunziekten.
, 8. Geef aan waar de volgende items zich zouden kunnen bevinden in de vectoren en leg hun rol uit:
- ORI: een genetische sequentie dat dient als een initiatie site voor de replicatie van DNA. De ORI bevindt zich
helemaal aan t begin.
De oorsprong van replicatie (ook wel de oorsprong van replicatie genoemd) is een bepaalde sequentie in een
genoom waarop replicatie wordt geïnitieerd. Dit kan de replicatie van DNA in levende organismen zoals
prokaryoten en eukaryoten inhouden, of die van DNA of RNA in virussen, zoals dubbelstrengs RNA-virussen.
DNA-replicatie kan vanaf dit punt bidirectioneel of unidirectioneel plaatsvinden.
De specifieke structuur van de oorsprong van replicatie verschilt enigszins van soort tot soort, maar ze
hebben allemaal een aantal gemeenschappelijke kenmerken, zoals een hoog AT-gehalte (herhalingen van
adenine en thymine zijn gemakkelijker te scheiden omdat hun basisstapelingsinteracties niet zo sterk zijn als
die van guanine en thymine. cytosine). De oorsprong van replicatie bindt het pre-replicatiecomplex, een
eiwitcomplex dat DNA herkent, afwikkelt en begint te kopiëren.
- Bacterial Plasmid Origin (BPO): Veel bacteriën, waaronder E. coli, bevatten plasmiden die elk een
oorsprong van replicatie bevatten. Deze staan los van de oorsprong van replicatie die door de bacteriën wordt
gebruikt om hun genoom te kopiëren en functioneren vaak heel anders.
- Promotor: een genetische sequentie van ongeveer 100 tot 1000 basenparen lang dat zicht upstream bevindt
van de doelwit genen. Deze sequentie reguleert de binding van RNA-polymerase en transcriptiefactoren,
waardoor het bepaald of een gen tot expressie komt of niet. Het komt na de ORI.
- Enhancer: een regulatoire DNA sequentie die, wanneer gebonden aan transcriptiefactoren, de transcriptie
van het desbetreffende gen verbeteren. Het kan de transcriptie van genen verhogen.
Enhancers zijn over het algemeen cis-werkend, gelokaliseerd tot 1 Mbp (1.000.000 bp) verwijderd van het
gen en kunnen stroomopwaarts of stroomafwaarts van de startlocatie zijn, en in voorwaartse of achterwaartse
richting. Er zijn honderdduizenden versterkers in het menselijk genoom.
- Signaalpeptide: korte peptideketen (16-30 aminozuren lang) die voorkomt aan de N-terminus (begin) van
veel nieuw gesynthetiseerde eiwitten. Ze zorgen ervoor dat deze eiwitten naar hun juiste bestemming worden
vervoerd. Bij aankomst worden ze afgesplitst.
- Restrictie-enzym herkenningsplekken: een sequenite van 4-8 basenbaren die worden herkend door
restrictie enzymen. Deze herkennen deze herkenningsplek en splitsen daar de DNA-streng op een bepaalde
manier.
- Eiwit-tag: een peptide sequentie die makkelijk kan worden verwijderd van het recombinante eiwit. Het heeft
als functie dat hierdoor het recombinante eiwit makkelijk kan worden gezuiverd van de biologische origine
middels affiniteitsbinding.
- 5’UTR: regio van mRNA dat direct upstream is van het initiatiecodon. Het deel van de promotor naar de 5’ site
toe.
- Kozak sequentie: een nucleotidezuur motief dat fungeert als de eiwit translatie initiatie kant voor de meeste
eukaryotische mRNA transcripties. De AUG is het initiatiecodon dat codeert voor een methione-aminozuur
aan de N-terminus van het eiwit. Variatie binnen de Kozak-sequentie verandert de “sterkte”daarvan. De
sterkte van de Kozak-sequentie bepaalt de voorkeur van initiatie en beïnvloedt hoeveel proteïne er wordt
gesynthetiseerd uit bepaald mRNA.
- Startcodon: het eerste codon van mRNA dat wordt getranslateert door een ribosoom en bevindt zich direct
na de promotor.
- Poly-A signaalsequentie: een staart aan een mRNA streng dat bestaat uit meerdere A-sequenties dat de
gen-expressie beïnvloedt. Het is belangrijk voor het transport van de nucleus naar het cytosol voor translatie.
Daarnaast beschermt het mRNA voor degradatie.
- Resistentiemarker: een resistentiegen voor een bepaalde antibiotica, hierdoor zorg je ervoor dat je dat
antibiotica kan toevoegen aan je kweek en je mengsel puur wordt.
9. Op plasmids bevinden zich vaak meerdere open reading frames (ORF’s)
a. Wat zijn ORF’s?
- ORF (Open Reading Frame): het gedeelte van het DNA dat getranscribeerd of mRNA getranslateerd kan
worden. Het ORF begint met een startcodon en eindigt met een stopcodon.
b. Als het startcodon niet bekend is, op hoeveel verschillende manieren kan een DNA-sequentie vertaald
worden in een eiwitsequentie (theoretisch)?
- Je hebt altijd maximaal 6 mogelijkheden. Drie op de forward en 3 op de reverse strand die tot compleet
verschillende aminozuursequenties zullen leiden. EcoRI
10. De ontdekking van restrictie enzymen heeft de recombinant DNA-techniek
mogelijk gemaakt. Er zijn op dit moment honderden verschillende restrictie- KpnI
enzymen commercieel verkrijgbaar. Ga naar de website van een van de StuI
genoemde bedrijven en zoek hoe de enzymen EcoRI, KpnI, StuI, NotI, XhoI en
SalI knippen. Welke sequentie herkennen ze? Wat valt je op? NotI
- Wat mij opvalt is dat ze allemaal tussen bepaalde basen knippen en dat XhoI
dan op de complementaire streng ook doen. De strengen zijn nooit even
lang. SalI
- Biologische geneesmiddelen: eiwitten die te groot zijn om te synthetiseren. Het zijn hele grote eiwit
geneesmiddelen.
- Ribosoom: van bacteriën of eukaryoten krijgen een stappenplan om eiwitten te produceren. Er wordt DNA
toegediend, Recombinant DNA.
- Recombinant DNA: instructie voor het produceren van een bepaald eiwit dat misschien niet in het organisme zelf
hoort, maar door dit DNA wel toe wordt aangezet.
- Proces: klonen van Recombinante DNA, eiwitproductie, purificatie en formulering voor opslag.
- Cellen: worden gebruikt om het te produceren.
Kloning middels bacterie: Circulair DNA wordt in een plasmide geplaatst, hier zit een promotor in (kies er
een die altijd aan staat voor efficiëntste productie), een gen van interesse en een resistentiegen tegen
antibiotica in. Hiermee kun je controleren welke bacterie het opneemt en welke niet.
mRNA: wordt uit een cel gehaald die dit gen wel bevat. Voor het Recombinante gen kun je een mRNA maken
die werkt en die terug synthetiseren naar cDNA, aangezien er alleen DNA in de plasmide kan. Dit gebeurt
middels een reverse transcriptase. Daarna wordt het geamplificeerd met PCR. Dan heb je alleen nog maar de
coderende sequentie. Er worden restrictie-enzymen gebruikt om het DNA goed te knippen en plakken in de
vector (plasmide). Ligasen zorgen ervoor dat het DNA covalent wordt gebonden aan de vector.
WC 1 - Pharmaceutical Biotechnology & Recombinant DNA Technology
1.3 History of Pharmaceutical Biotechnology
Introduction to Pharmaceutical Biotechnology
Biotechnologie: het gebruik van biologische processen, levende cellen of organismen om producten te maken
die nuttig zijn voor de mensheid.
- Groene biotechnologie: agricultureel.
- Witte biotechnologie: industrieel.
- Rode biotechnologie: medisch.
- Blauwe biotechnologie: aquatisch.
Farmaceutische biotechnologie: het gebruik van biologische processen, levende cellen of organismen om
therapeutische of diagnostische producten te produceren.
Eerst werd het gedaan door stoffen te isoleren uit levende dieren maar dat kan gecontamineerd zijn. Dit leidde tot
de uitvinding van recombinant DNA techniek in de 1970s. Het werd mogelijk om ieder eiwit te produceren middels
levende cellen.
Recombinant human insulin werd in 1982 uitgevonden en in bacteriën gestopt om op grote schaal pure insuline
te produceren. Insuline was de eerste structuur die op deze manier geproduceerd werd.
Biopharmaceuticals: farmaceutische geneesmiddelproducten die geproduceerd worden in, geïsoleerd worden
uit of semi gesynthetiseerd worden uit levende systemen zoals cellen of organismen. Ze zijn zeer groot en
gecompliceerd, in tegenstelling tot normale kleine molecuul geneesmiddelen. Ze kunnen worden onderverdeeld in
8 klassen:
1. Groei factoren en cytokines.
2. Hormonen.
3. Coagulatie factoren.
4. Antitrombose factoren.
5. Therapeutische antilichamen (grootste klasse).
6. Therapeutische enzymen.
7. Vaccins.
8. Nucleotidezuur gebaseerde geneesmiddelen.
1.4 The Making of Protein Therapies
Sanofi Genzyme
Veel ziektes worden geoorzaakt door missende of kapotte enzymen.
Genzyme: een methode die mammalian cellen modificeert door er een stukje menselijk DNA aan toe te voegen,
zodat ze therapeutische eiwitten kunnen produceren. De geproduceerde eiwitten kunnen gebruikt worden als
targeted behandelingen of ter vervanging van missende of kapotte enzymen.
Cell bank: De geproduceerde cellen worden gegroeid en zorgvuldig bevroren in stikstof, voor toekomstig gebruik.
Dit vormt een opslag.
Er worden cellen uit de cell bank genomen en in een reactor geplaatst met groeimedium, waardoor de cellen zich
gaan vermeerderen. Over tijd worden ze naar een steeds grotere bioreactor verplaatst om zo steeds meer ruimte
te creëren voor nieuwe cellen. Als er voldoende cellen zijn geproduceerd worden ze in een medium geplaatst dat
ervoor zorgt dat ze het te verkrijgen eiwit gaan produceren. Wanneer er voldoende is geproduceerd wordt het
mengsel in de reactor gezuiverd van alles behalve het eiwit, zodat je alleen eiwit overhoudt. Dit wordt daarna
verpakt en zorgvuldig gecontroleerd en verzonden naar patiënten.
,1. Wat zijn de grootste verschillen tussen kleine molecuul geneesmiddelen en biopharmaceuticals?
Karakteristieken Kleine moleculen Biopharmaceuticals
Soort moleculen Relatief simpele chemische moleculen Complexe macromoleculen
Herkomst Ontdekking door libraryscreening Biologisch bestaan
Kosten Vaak goedkoop om te produceren Vaak duur om te produceren
Species Geen speciesbeperkingen Species specifiek
Activity Actief intra- en extracellulair Meestal extracellulair actief
Delivery Orale en parenterale delivery Niet oraal acties, gaan niet door BBB
Bijwerkingen/toxiciteit Bijwerkingen en toxiciteit komt voor Toxiciteit komt minder vaak voor
Eliminatie Snelle eliminatie Eliminatie is afhankelijk van BP
2. Waarom spreken we over biosimilars en niet biogenerics?
- We spreken van biosimilars in plaats van generieke geneesmiddelen, aangezien kopieën van biologische
geneesmiddelen niet altijd identiek zijn aan het oorspronkelijke geneesmiddel vanwege de complexiteit van de
actieve geneesmiddelsubstanties (de eiwitten of nucleïnezuren) en de manier waarop ze worden
geproduceerd. Verschillen in het productieproces kunnen leiden tot subtiele verschillen in de 3D-structuur en /
of posttranslationele modificaties van een eiwit die kunnen bijdragen aan een ander farmacokintetisch of
farmacodynamisch profiel.
1.5 Oefeningen - DNA, RNA en eiwitten
1. Hieronder staat het begin van de dubbelstrengse DNA sequentie van een gen (intron in kleine letters, exon in
hoofdletters, het startcon is onderstreept).
5’....caggcgcCGGAGGACTAGCCTGGGGTCACAGGGATGCCGCGGCTCCTCCGCTTGTCCCTGCTGT...
3’....gtccgcgGCCTCCTGATCGGACCCCAGTGTCCCTACGGCGCCGAGGAGGCGAACAGGGACGACA...
a. Wat is het verschil tussen de template strand en coding strand van het DNA? Welke kant zal worden
gekopieerd door RNA polymerase II?
- Een template streng is complementair aan een coderende streng. Omdat een RNA polymerase II een
streng kopieert, complementair aan de streng waar die aan vast zit (template streng), zal de nieuwe
streng gelijk zijn in nucleotidesequentie aan de coderende streng. Vandaar de naam ook, de coderende
streng codeert de sequentie van de nieuwe streng en de templatestreng is de houvast waar de
complementaire streng aan vast wordt gesynthetiseerd.
b. Beredeneer hoe de mRNA sequentie en de eiwit sequentie er uit zullen zien (gebruik hiervoor onderstaande
codon tabel).
- Een RNA polymerase II gaat altijd van de 3’ naar 5’ kant van de template streng. In dit geval wordt er dan
eerst het startcodon gesynthetiseerd en daarna wordt de sequentie van de nieuwe streng gelijk aan het
blauwe deel van de 5’ streng (coderende streng). Daarnaast moet er rekening gehouden worden met dat
A niet aan Thymine bindt maar aan Uracil.
- De aminozuursequentie wordt dan: AUGCCGCGGCUCCUCCGCUUGUCCCUGCUGU…
- MPRLLRLFSLL… wordt de eiwitsequentie. Er is nog geen stopcodon tegengekomen dus het echte eiwit
is waarschijnlijk langer.
2. Een DNA sequentie bestaat uit een herhaling van vier letters (basen).
a. Geef de structuur van deze vier basen en laat zien hoe de basenparing ontstaat.
b. Welk basenpaar bindt sterker?
- De binding tussen Cytosine (C) en Guanine (G) is het sterkst omdat hiertussen 3 waterstofbruggen
vormen terwijl de binding tussen Thymine (T) en Adenine (A) er maar twee vormt.
3. Wat is het verschil in structuur tussen DNA en RNA?
- DNA: bevat een 2-Deoxyribose en de nucleotiden adenine, cytosine, guanine en thymine. Daarnaast komt het
dubbelstrengs voor.
, - RNA: bevat een ribose en de nucleotiden adenine, cytosine, guanine en uracil in plaats van thymine.
Daarnaast komt het enkelstrengs voor.
4. Onderstaande processen vinden plaats in een eukaryote cel.
a. Geef van elk proces aan in welk subcellulair compartiment deze plaatsvindt.
Proces Locatie
RNA synthese Nucleus.
Eiwit synthese Ribosoom.
Eiwit glycolysering Endoplasmatisch reticulum en Golgi lichaam.
RNA splicing Nucleus.
b. Hoe verschilt dit van een prokaryotische cel?
- Een prokariotische cel heeft geen celkern en de RNA en eiwit synthese vinden beiden (gelijktijdig) in het
cytoplasma van de cel plaats, er is geen splicing. Glycosilering is beperkt en vind voornamelijk plaats aan
de buitenkant van het plasma membraan (in het periplasma).
5. Wat is de functie van een promotor? Waar wordt hij normaal gevonden in de sequentie, upstream of downstream
van het gen?
- Promotor: De promotorsequentie is een
DNA sequentie, die bepaalt waar
transcriptie van een gen door RNA-
polymerase begint. De promotor ligt
direct upstream (vlak voor) het af te
lezen gen. RNA-polymerase en de
benodigde transcriptiefactoren kunnen
binden aan de promotorsequentie en
transcriptie starten.
- Upstream: van de 3’ naar 5’ kant van het RNA molecuul.
- Downstream: van de 5’ naar 3’ kant van het RNA molecuul.
6. Geef van de onderstaande RNA’s aan wat hun functie in de cel is:
- mRNA (messengerRNA): wordt gevormd uit de transcriptie van DNA tot pre-mRNA dat daarna RNA-splicing
ondergaat tot mRNA en daarna translatie ondergaat naar een eiwit.
DNA → transcriptie → pre-mRNA →RNA-splicing → mRNA → translatie → eiwit.
- Ribosomaal RNA: onderdeel van het ribosoom dat als functie heeft om de reactie die de eiwitketen verlengt
te katalyseren. Belangrijk voor de structuur/functie van het ribosoom (ribosoom bestaat voor 60% uit rRNA en
40% protein uit eiwit)
- MicroRNA: een vorm van niet-coderend RNA van 20 tot 25 nucleotiden lang en is onderdeel van de
epigenetische mechanismen die de expressie van genen reguleren. Het is complementair aan een stukje
sequentie van één of meerdere mRNA’s in het gebied 3’ UTR. Door op deze plaats een dubbele streng met
het mRNA te vormen wordt de translatie van het mRNA tegengehouden. 3’ UTR is alles wat na het stopcodon
zit.
- tRNA (transfer-RNA): een molecuul dat bindt aan codons op een mRNA middels zijn anticodon en bindt het
het aminozuur dat erbij hoort vast aan de al bestaande aminozuurketen, zo plakt het telkens aminozuren aan
het vormende eiwit, volgens de nucleotidesequentie.
7. N-linked glycolysering is belangrijk voor de functie van eiwitten.
a. In welk compartiment vindt N-linked glycolysering van eiwitten plaats?
- N-linked glycolysation: is de aanhechting van een oligosaccharide, een koolhydraat bestaande uit
verschillende suikermoleculen, soms ook wel glycaan genoemd, aan een stikstofatoom (de amidestikstof
van een asparagine overblijfsel van een eiwit. Dit proces gebeurt in het golgi lichaam en het
endoplasmatische reticulum.
b. Wat is het effect van deze posttranslationele modificatie op de stabiliteit en oplosbaarheid van een eiwit?
- Functies van N-linked glycanenL
Intrinstiek 1. Zorgt voor structurele componenten voor de celwand en extracellulaire matrix.
2. Modificeert eiwiteigeinschappen zoals stabiliteit en oplosbaarheid.
Extrinstiek 1. Leidt het verplaatsen van glycoproteïnen.
2. Medieert cel signalering.
c. Waarom is het belangrijk om te weten dat N-linked glycolysering van organisme tot organisme verschilt?
- Verschillende species synthetiseren verschillende types van N-linked glycaan. Hiermee moet je rekening
houden omdat het de vouwing van een eiwit beïnvloedt.
- Therapeutische eiwitten die gemaakt zijn in een andere soort kunnen afwijkende glycolysering hebben
wat van invloed kan zijn op de functie en herkenning door het immuunsysteem (afweerreactie tegen het
eiwit).
- Glycanen kunnen ook betrokken zijn bij 'zelf'- en' niet-zelf'-discriminatie, wat relevant kan zijn voor de
pathofysiologie van verschillende auto-immuunziekten.
, 8. Geef aan waar de volgende items zich zouden kunnen bevinden in de vectoren en leg hun rol uit:
- ORI: een genetische sequentie dat dient als een initiatie site voor de replicatie van DNA. De ORI bevindt zich
helemaal aan t begin.
De oorsprong van replicatie (ook wel de oorsprong van replicatie genoemd) is een bepaalde sequentie in een
genoom waarop replicatie wordt geïnitieerd. Dit kan de replicatie van DNA in levende organismen zoals
prokaryoten en eukaryoten inhouden, of die van DNA of RNA in virussen, zoals dubbelstrengs RNA-virussen.
DNA-replicatie kan vanaf dit punt bidirectioneel of unidirectioneel plaatsvinden.
De specifieke structuur van de oorsprong van replicatie verschilt enigszins van soort tot soort, maar ze
hebben allemaal een aantal gemeenschappelijke kenmerken, zoals een hoog AT-gehalte (herhalingen van
adenine en thymine zijn gemakkelijker te scheiden omdat hun basisstapelingsinteracties niet zo sterk zijn als
die van guanine en thymine. cytosine). De oorsprong van replicatie bindt het pre-replicatiecomplex, een
eiwitcomplex dat DNA herkent, afwikkelt en begint te kopiëren.
- Bacterial Plasmid Origin (BPO): Veel bacteriën, waaronder E. coli, bevatten plasmiden die elk een
oorsprong van replicatie bevatten. Deze staan los van de oorsprong van replicatie die door de bacteriën wordt
gebruikt om hun genoom te kopiëren en functioneren vaak heel anders.
- Promotor: een genetische sequentie van ongeveer 100 tot 1000 basenparen lang dat zicht upstream bevindt
van de doelwit genen. Deze sequentie reguleert de binding van RNA-polymerase en transcriptiefactoren,
waardoor het bepaald of een gen tot expressie komt of niet. Het komt na de ORI.
- Enhancer: een regulatoire DNA sequentie die, wanneer gebonden aan transcriptiefactoren, de transcriptie
van het desbetreffende gen verbeteren. Het kan de transcriptie van genen verhogen.
Enhancers zijn over het algemeen cis-werkend, gelokaliseerd tot 1 Mbp (1.000.000 bp) verwijderd van het
gen en kunnen stroomopwaarts of stroomafwaarts van de startlocatie zijn, en in voorwaartse of achterwaartse
richting. Er zijn honderdduizenden versterkers in het menselijk genoom.
- Signaalpeptide: korte peptideketen (16-30 aminozuren lang) die voorkomt aan de N-terminus (begin) van
veel nieuw gesynthetiseerde eiwitten. Ze zorgen ervoor dat deze eiwitten naar hun juiste bestemming worden
vervoerd. Bij aankomst worden ze afgesplitst.
- Restrictie-enzym herkenningsplekken: een sequenite van 4-8 basenbaren die worden herkend door
restrictie enzymen. Deze herkennen deze herkenningsplek en splitsen daar de DNA-streng op een bepaalde
manier.
- Eiwit-tag: een peptide sequentie die makkelijk kan worden verwijderd van het recombinante eiwit. Het heeft
als functie dat hierdoor het recombinante eiwit makkelijk kan worden gezuiverd van de biologische origine
middels affiniteitsbinding.
- 5’UTR: regio van mRNA dat direct upstream is van het initiatiecodon. Het deel van de promotor naar de 5’ site
toe.
- Kozak sequentie: een nucleotidezuur motief dat fungeert als de eiwit translatie initiatie kant voor de meeste
eukaryotische mRNA transcripties. De AUG is het initiatiecodon dat codeert voor een methione-aminozuur
aan de N-terminus van het eiwit. Variatie binnen de Kozak-sequentie verandert de “sterkte”daarvan. De
sterkte van de Kozak-sequentie bepaalt de voorkeur van initiatie en beïnvloedt hoeveel proteïne er wordt
gesynthetiseerd uit bepaald mRNA.
- Startcodon: het eerste codon van mRNA dat wordt getranslateert door een ribosoom en bevindt zich direct
na de promotor.
- Poly-A signaalsequentie: een staart aan een mRNA streng dat bestaat uit meerdere A-sequenties dat de
gen-expressie beïnvloedt. Het is belangrijk voor het transport van de nucleus naar het cytosol voor translatie.
Daarnaast beschermt het mRNA voor degradatie.
- Resistentiemarker: een resistentiegen voor een bepaalde antibiotica, hierdoor zorg je ervoor dat je dat
antibiotica kan toevoegen aan je kweek en je mengsel puur wordt.
9. Op plasmids bevinden zich vaak meerdere open reading frames (ORF’s)
a. Wat zijn ORF’s?
- ORF (Open Reading Frame): het gedeelte van het DNA dat getranscribeerd of mRNA getranslateerd kan
worden. Het ORF begint met een startcodon en eindigt met een stopcodon.
b. Als het startcodon niet bekend is, op hoeveel verschillende manieren kan een DNA-sequentie vertaald
worden in een eiwitsequentie (theoretisch)?
- Je hebt altijd maximaal 6 mogelijkheden. Drie op de forward en 3 op de reverse strand die tot compleet
verschillende aminozuursequenties zullen leiden. EcoRI
10. De ontdekking van restrictie enzymen heeft de recombinant DNA-techniek
mogelijk gemaakt. Er zijn op dit moment honderden verschillende restrictie- KpnI
enzymen commercieel verkrijgbaar. Ga naar de website van een van de StuI
genoemde bedrijven en zoek hoe de enzymen EcoRI, KpnI, StuI, NotI, XhoI en
SalI knippen. Welke sequentie herkennen ze? Wat valt je op? NotI
- Wat mij opvalt is dat ze allemaal tussen bepaalde basen knippen en dat XhoI
dan op de complementaire streng ook doen. De strengen zijn nooit even
lang. SalI
