Biotechnologie uitwerkingen
Inhoud
Hoorcollege 1........................................................................................................... 2
Hoorcollege 2........................................................................................................... 8
Hoorcollege 3......................................................................................................... 18
Hoorcollege 4................................................................ Error! Bookmark not defined.
Hoorcollege 5................................................................ Error! Bookmark not defined.
Werkcolleges ................................................................ Error! Bookmark not defined.
,Hoorcollege 1 Basis technieken
Genetische merkers
Een genetische merker is een locatie op het DNA waarvan we de allelsequentie weten.
Op DNA niveau betekend dit dat we de nucleotidesequentie weten. We kunnen variatie
in de DNA-sequentie waarnemen op drie locaties: Op het DNA, op het mRNA, en in
eiwitten. Op genetische markers (waarvan we de sequentie weten) kunnen we zien
wanneer een nucleotide afwijkt van de normale sequentie. In het mRNA kunnen we
ditzelfde verschil terug zien en in de eiwitten zal de aminozuur volgorde veranderen.
Moleculaire technieken
• DNA extractie/isolatie
• DNA restrictie
• DNA ligatie
• DNA hybridisatie
• DNA synthese
• DNA replicatie/amplificatie
• DNA visualisatie
DNA extractie/isolatie
DNA kan verkregen worden op verschillende manieren. We kunnen DNA uit een cel
halen of het zelf synthetiseren. Om DNA uit een cel te halen zijn verschillende processen
nodig die de cel doen oplossen en het DNA verkrijgbaar maken. In een eukaryote cel
kunnen we het DNA verkrijgen uit de celkern, het mitochondrium, en bij planten uit de
chloroplasten. Bij de isolatie van DNA moeten celwanden, celmembranen en eiwitten
afgebroken worden. Door lysatie van de cel (fysisch afbreken) worden celwanden en
celmembranen kapot gemaakt. Door het toevoegen van protease enzymen worden
eiwitten afgebroken. Door het toevoegen van koude ethanol zal DNA precipiteren
(neerslaan), waardoor we het kunnen pipeteren en het DNA geïsoleerd is. Enkele
methodes waar dit wordt toegepast zijn PCR (polymerase chain-reaction), gel-
elektroforese en nucleïnezuur hybridisatie.
DNA restrictie
Om met DNA te werken hebben we vaak maar een gedeelte van de DNA sequentie
nodig. Om deze specifieke sequentie te verkrijgen moeten we een proces genaamd
restrictie uitvoeren. Gespecialiseerde enzymen die we restrictie enzymen noemen zitten
van origine in prokaryote cellen om onbekend DNA af te breken. Deze restrictie enzymen
lezen het DNA af en knippen het door op een zeer specifieke DNA-sequentie. Er zijn
duizende verschillende restrictie enzymen die elk een specifieke restrictie site heeft.
zo’n restrictie site is een nucleotidevolgorde waarbij een enzym zal knippen.
,Na de isolatie van het DNA worden restrictie enzymen
toegevoegd aan de oplossing. We zien dat ze de
sequentie ‘GAATTC’ aflezen en tussen de G en A knippen.
Dit restrictie enzym knipt in een soort ‘Z’ vorm door het
DNA waardoor de uiteindes een zogenaamd ‘sticky end’
krijgen. Er zijn ook restrictie enzymen die verticaal
knippen en een ‘blunt’ einde maakt.
Figuur 19.5 campbell
DNA ligatie
DNA ligatie is het aan elkaar hechten van DNA
fragmenten door het enzym ligase. Dit gebeurt bij de
DNA replicatie, conjugatie, inbouwen van ssDNA enz.
Ook bij moleculaire DNA technieken is ligatie een
belangrijke stap. Nadat restrictie enzymen het DNA
hebben geknipt, kan een DNA fragment worden
toegevoegd aan de oplossing samen met ligase
enzymen. De ligase enzymen brengen de DNA
fragmenten samen en plakken deze aan elkaar om één
dsDNA te vormen.
Ligase weet waar DNA geknipt is omdat het, het 3’-
hydroxyeinde en het 5’-fosfaateinde waarneemt en hier
een covalente fosfodi-esterbinding gaat vormen.
DNA hybridisatie
Hybridisatie is het proces waarbij twee ssDNA of ssRNA aan elkaar binden door
waterstofbruggen te vormen en zo dsDNA of dsRNA te maken. De volgorde “5’→3’”,
waarin we DNA aflezen komt van de manier waarom we DNA lezen. 5’ representeert het
5e koolstofatoom op het suikermolecuul waar fosfaat zit gekoppeld. Als we vanaf dit
atoom naar beneden aflezen eindigen we op het 3e atoom. Vandaar de naamgeving en
de aanduiding.
Tijdens de replicatie is DNA-polymerase verantwoordelijk voor de hybridisatie van
ssDNA. Hij plakt nucleotide op het ssDNA en maakt zo dsDNA.
, DNA synthese
Kleine stukken DNA van 18 tot 1000 nucleotide noemen we oligonucleotides. Er zijn
producten op de markt beschikbaar die we gebruiken voor de DNA synthese. Primers
zijn oligonucleotides van 18 tot 25 nucleotide (ssDNA), die onmisbaar zijn bij de DNA
synthese. Ze zijn nodig om de gehele reactie te laten starten. Ze binden op het DNA
zodat DNA-polymerase weet waar hij moet starten met de hybridisatie.
Adapters zijn ook oligonucleotides van 18 tot 25 nucleotide die binden op het target DNA
om bijvoorbeeld aan een oppervlakte te binden (next generation sequencing).
Probes zijn ook oligonucleotides van 100 tot 1000 nucleotide. Het zijn gelabelde stukjes
DNA of RNA waarvan de structuur volledig complementair (baseparen sluiten aan) is
aan het op te sporen stuk DNA of RNA.
Inhoud
Hoorcollege 1........................................................................................................... 2
Hoorcollege 2........................................................................................................... 8
Hoorcollege 3......................................................................................................... 18
Hoorcollege 4................................................................ Error! Bookmark not defined.
Hoorcollege 5................................................................ Error! Bookmark not defined.
Werkcolleges ................................................................ Error! Bookmark not defined.
,Hoorcollege 1 Basis technieken
Genetische merkers
Een genetische merker is een locatie op het DNA waarvan we de allelsequentie weten.
Op DNA niveau betekend dit dat we de nucleotidesequentie weten. We kunnen variatie
in de DNA-sequentie waarnemen op drie locaties: Op het DNA, op het mRNA, en in
eiwitten. Op genetische markers (waarvan we de sequentie weten) kunnen we zien
wanneer een nucleotide afwijkt van de normale sequentie. In het mRNA kunnen we
ditzelfde verschil terug zien en in de eiwitten zal de aminozuur volgorde veranderen.
Moleculaire technieken
• DNA extractie/isolatie
• DNA restrictie
• DNA ligatie
• DNA hybridisatie
• DNA synthese
• DNA replicatie/amplificatie
• DNA visualisatie
DNA extractie/isolatie
DNA kan verkregen worden op verschillende manieren. We kunnen DNA uit een cel
halen of het zelf synthetiseren. Om DNA uit een cel te halen zijn verschillende processen
nodig die de cel doen oplossen en het DNA verkrijgbaar maken. In een eukaryote cel
kunnen we het DNA verkrijgen uit de celkern, het mitochondrium, en bij planten uit de
chloroplasten. Bij de isolatie van DNA moeten celwanden, celmembranen en eiwitten
afgebroken worden. Door lysatie van de cel (fysisch afbreken) worden celwanden en
celmembranen kapot gemaakt. Door het toevoegen van protease enzymen worden
eiwitten afgebroken. Door het toevoegen van koude ethanol zal DNA precipiteren
(neerslaan), waardoor we het kunnen pipeteren en het DNA geïsoleerd is. Enkele
methodes waar dit wordt toegepast zijn PCR (polymerase chain-reaction), gel-
elektroforese en nucleïnezuur hybridisatie.
DNA restrictie
Om met DNA te werken hebben we vaak maar een gedeelte van de DNA sequentie
nodig. Om deze specifieke sequentie te verkrijgen moeten we een proces genaamd
restrictie uitvoeren. Gespecialiseerde enzymen die we restrictie enzymen noemen zitten
van origine in prokaryote cellen om onbekend DNA af te breken. Deze restrictie enzymen
lezen het DNA af en knippen het door op een zeer specifieke DNA-sequentie. Er zijn
duizende verschillende restrictie enzymen die elk een specifieke restrictie site heeft.
zo’n restrictie site is een nucleotidevolgorde waarbij een enzym zal knippen.
,Na de isolatie van het DNA worden restrictie enzymen
toegevoegd aan de oplossing. We zien dat ze de
sequentie ‘GAATTC’ aflezen en tussen de G en A knippen.
Dit restrictie enzym knipt in een soort ‘Z’ vorm door het
DNA waardoor de uiteindes een zogenaamd ‘sticky end’
krijgen. Er zijn ook restrictie enzymen die verticaal
knippen en een ‘blunt’ einde maakt.
Figuur 19.5 campbell
DNA ligatie
DNA ligatie is het aan elkaar hechten van DNA
fragmenten door het enzym ligase. Dit gebeurt bij de
DNA replicatie, conjugatie, inbouwen van ssDNA enz.
Ook bij moleculaire DNA technieken is ligatie een
belangrijke stap. Nadat restrictie enzymen het DNA
hebben geknipt, kan een DNA fragment worden
toegevoegd aan de oplossing samen met ligase
enzymen. De ligase enzymen brengen de DNA
fragmenten samen en plakken deze aan elkaar om één
dsDNA te vormen.
Ligase weet waar DNA geknipt is omdat het, het 3’-
hydroxyeinde en het 5’-fosfaateinde waarneemt en hier
een covalente fosfodi-esterbinding gaat vormen.
DNA hybridisatie
Hybridisatie is het proces waarbij twee ssDNA of ssRNA aan elkaar binden door
waterstofbruggen te vormen en zo dsDNA of dsRNA te maken. De volgorde “5’→3’”,
waarin we DNA aflezen komt van de manier waarom we DNA lezen. 5’ representeert het
5e koolstofatoom op het suikermolecuul waar fosfaat zit gekoppeld. Als we vanaf dit
atoom naar beneden aflezen eindigen we op het 3e atoom. Vandaar de naamgeving en
de aanduiding.
Tijdens de replicatie is DNA-polymerase verantwoordelijk voor de hybridisatie van
ssDNA. Hij plakt nucleotide op het ssDNA en maakt zo dsDNA.
, DNA synthese
Kleine stukken DNA van 18 tot 1000 nucleotide noemen we oligonucleotides. Er zijn
producten op de markt beschikbaar die we gebruiken voor de DNA synthese. Primers
zijn oligonucleotides van 18 tot 25 nucleotide (ssDNA), die onmisbaar zijn bij de DNA
synthese. Ze zijn nodig om de gehele reactie te laten starten. Ze binden op het DNA
zodat DNA-polymerase weet waar hij moet starten met de hybridisatie.
Adapters zijn ook oligonucleotides van 18 tot 25 nucleotide die binden op het target DNA
om bijvoorbeeld aan een oppervlakte te binden (next generation sequencing).
Probes zijn ook oligonucleotides van 100 tot 1000 nucleotide. Het zijn gelabelde stukjes
DNA of RNA waarvan de structuur volledig complementair (baseparen sluiten aan) is
aan het op te sporen stuk DNA of RNA.
