Biotechnologie samenvatting voor tentamen

Biotech samenvatting voor tentamen

Hoorcollege 1 stof:

Zichtbaar maken van variatie in DNA en genexpressie kan op 3 niveaus:

1. DNA → genetische variatie

2. (m)RNA → genexpressie verschillen

3. Eiwit → genexpressie verschillen
en/of genetische variatie

Moleculaire technieken met DNA:

• DNA extractie (zuiveren): DNA isoleren uit cellen.

• DNA restrictie (knippen)

• DNA ligatie (plakken)

• DNA hybridisatie (complementaire enkelstrengs DNA (ssDNA) strengen
samenvoegen tot dubbelstrengs DNA (dsDNA) / een dubbele helix

• DNA replicatie of amplificatie (vermenigvuldigen)

• DNA visualisatie (zichtbaar maken)



Er zijn 3 DNA-bronnen mogelijk in een eukaryote cel:

,DNA isolatie:
Lyseren van de cellen:
Dit kan bijvoorbeeld door het weefsel fijn te malen, en/of door een soort zeep toe te voegen
waardoor het celmembraan uit elkaar valt.

Eiwitten verwijderen (niet altijd nodig):
Eiwitten worden meestal afgebroken door een protease enzym toe te voegen dat eiwitten
afbreekt.

DNA ‘uit oplossing halen’:
Door een ijskoude alcohol toe te voegen, precipiteert (=neerslaan) het DNA.
DNA lost minder goed op in alcohol dan in water.
Het neergeslagen DNA kan vervolgens uit de oplossing worden gehaald, bijvoorbeeld door te
centrifugeren of door het met een pipet op te zuigen.



DNA restrictie:
Restrictie enzymen knippen een specifieke DNA
sequentie van
ds DNA. Verschillende restrictie enzymen knippen
verschillende sequenties.

Hierherkent een restrictive enzym de GAAT groep en
gaat hij tussen de G en de A zitten. →

Natuurlijke functies in de cel: bijvoorbeeld vernietigen
van virus DNA of inbouwen opgenomen gen in
bacteriechromosoom

Worden gebruikt om DNA moleculen kleiner te maken

➔ Willekeurig, Gericht.

Sommige restrictie enzymen knippen het DNA recht doormidden (blunt),
andere knippen het DNA ‘diagonaal’ en zorgen voor korte enkelstrengs uiteinden (sticky ends)

,DNA ligatie:
Ligatie is het aan elkaar hechten van DNA fragmenten door
een ligase enzym.

Ligatie is bijvoorbeeld nodig bij:
DNA replicatie; dit is in TB1 besproken
Het uitwisselen van genetische informatie tussen twee
bacteriën:
Na conjugatie (DNA van ene naar andere bacteriecel)
Het inbouwen van ssDNA na transformatie (opnemen vreemd
DNA) voordat hybridisatie plaatsvindt
Het inbouwen van dsDNA na transductie (DNA overdracht
door een virus

Recombinatie van het ssDNA van de bacterie en het
menselijke DNA vindt plaats doordat ze complimentair aan
elkaar zijn: de basenparen zijn gelijk waardoor ze op elkaar
passen door waterstofbruggen. DNA-ligase zorgt er dan voor
dat de gerecombineerde DNA strand niet meer los kan gaan.




DNA hybridisatie:
DNA-hybridisatie is de vorming van complementaire
baseparen door twee enkelstrengs moleculen met
elkaar te verbinden met waterstofbruggen.

Bij de DNA replicatie verzorgt het enzym DNA-
polymerase de hybridisatie.

, DNA replicatie:




Replicatie. Tijdens replicatie wordt de dubbele DNA-helix gedupliceerd. Replicatie wordt
gekatalyseerd door het enzym DNA-polymerase.

Transcriptie. De overdracht van genetische informatie van DNA naar RNA wordt transcriptie
genoemd. Transcriptie wordt gekatalyseerd door het enzym RNA-polymerase.

Translatie. De vorming van een polypeptide met behulp van de genetische informatie die door
DNA naar mRNA wordt overgebracht, is een proces dat plaatsvindt op het ribosoom.




DNA synthese:
Oligonucleotides:

Primers (enkelstrengs rond 18-25 nucleotiden)
nodig om DNA-polymerase te laten starten met de aanmaak van de complementaire DNA
streng.

Adapters (dubbelstrengs rond 18-25 nucleotiden)
korte stukjes DNA die zich hechten aan het target DNA om het bijv. aan een oppervlakte te
binden.

Probes (enkelstrengs ong. 100-1000 nucleotiden)
probes zijn gelabelde stukjes DNA of RNA waarvan de structuur volledig complementair is aan
het op te sporen stuk DNA of RNA.


DNA kopieren:
In vitro: PCR
in vivo: gene cloning