Samenvatting practica cursus immunologie

Practica immunologie

,Inhoud
Practica immunologie..........................................................................................

Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen.........................................................

1 De antigeen-antistofbinding.................................................................................................
Gevolg van Antigeen-antistof verbinding.............................................................................
2. Affiniteit en aviditeit............................................................................................................
Hoofdstuk 2: Aantonen antistoffen.......................................................................

2.1 Precipitatie........................................................................................................................
Algemeen principe..................................................................................................................
2.2 Agglutinatie..................................................................................................................... 10
Algemeen principe................................................................................................................ 10
2.3 Neutralisatie.................................................................................................................... 15
2.4 De complement-bindingsreactie...................................................................................... 16
2.5 Ligandbindingstesten...................................................................................................... 17
Hoofdstuk 3: Evaluatie van aantal en functies van immuuncellen.........................24

Appendix: lijst met cd-moleculen.......................................................................................... 36




Hoofdstuk 1: Eigenschappen van
antistoffen
1 De antigeen-antistofbinding
 Komt tot stand dankzij niet covalente krachten (zwak) (Figuur 1)
 Covalente krachten -> wanneer antigeen (Ag) en antilichaam (Al) zeer dicht benaderen
 Primaire binding tss antigeen en antistof gebeurt door Coulombse krachten en treedt snel op
 De secundaire binding gebeurt trager en kan gedurende uren tot dagen blijven toenemen
 Wnr antigeen en antistof korter komen ku H-bruggen gevormd w tss hydrofielen (-OH, -NH2, -COOH)
 H-bruggen -> minder vlug waterig milieu doordat water deelneemt aan de vorming waterstofbruggen

Coulombse-krachten (elektrostatische krachten)
 Tegengesteld geladen ionengroepen die elkaar aantrekken

1

, De kracht is omgekeerd evenredig met het kwadraat van de afstand tss ladingen
 Belangrijk bij begin van binding tss antigeen en antistof en weinig belangrijk in stabiliteit Ag-Al binding
 Deze bindingen zijn effectief over een afstand van 100 Å


Van der Waals-krachten
 Aantrekkingskracht tss oscillerende dipolen (dwz. afwisselend + en - ) in één atoom en geïnduceerde
oscillerende dipolen in een ander dipool
 Rol in primaire binding
 Werkzaam tot afstand van 1000 Å
 Omgekeerd evenredig met zevende macht van de afstand tss moleculen
 Zwakker dan de coulombse krachten

Waterstofbruggen
 Zwakke en omkeerbare interacties tussen hydrofiele groepen
 Geringe bijdrage in stabiliteit van Ag-Al binding
 Over zeer korte afstand werkzaam (1 tot 1.5 Å; zie hoger) en daardoor een rol in secundaire binding

Apolaire of hydrofobe krachten
 Werkzaam over korte afstand. Als van der Waals krachten en waterstofbruggen de moleculen dichter
naar elkaar toe trekken w water uitgedreven en kunnen hydrofobe krachten optreden




Gevolg van Antigeen-antistof verbinding
 Minder energie nodig om binding van antistof en antigeen te verhinderen dan om een bestaande
binding te verbreken
 Bv: als men bij een affiniteitszuivering de binding wil verbreken, moet dit zo snel mogelijk
 Hoe langer men de binding laat plaatsgrijpen, hoe sterker de binding
 Het is een evenwichtsreactie met Ka als reactieconstante bij associatie en Kd deze bij dissociatie
Ka

Antigeen (Ag) + As Ag-As

Kd

2. Affiniteit en aviditeit
 Affiniteit van een antistof: het vermogen van één antistofmolecule om aan één epitoop te binden
 Affiniteit is dus de mate waarin één antistof met zijn paratoop bindt aan het epitoop van het antigen
 Het gaat om een interactie ter hoogte van één individuele bindingsplaats
 De affiniteit = evenwichtsconstante Ka

2

, Ka hoog, weinig antigeen nodig om 50% van de bindingsplaatsen van de antistoffen te verzadigen
 Affiniteitsconstante is dus een maat voor affiniteit van antistof voor één epitoop van een antigeen
 Zegt niets over de snelheid waarmee de binding zal gebeuren
 Is de affiniteitsconstante gekend van een monoklonaal antistof in een bepaalde immunochemische
test voor een epitoop van een welbepaald antigeen, dan kan de hoeveelheid vrij antigeen kwantitatief
bepaald worden
 De affiniteits(associatie)constante van Ag en As w beïnvloed door een aantal reactieomstandigheden:

• pH: het effect pH wijzigingen hangt af van de aard van niet covalente krachten

• Ionensterkte: affiniteitsconstante kan verhoogd w door ionensterktete verlagen van de buffer
waarin de reactie plaatsgrijpt. De affiniteitsconstante kan verlaagd worden door de ionsterkte te
verhogen indien de binding vnl uit Coulombse krachten bestaat. Bestaat ze echter voornamelijk
uit hydrofobe bindingen dan kan de bindingssterkte toenemen.

• Temperatuur: Effect op reactiesnelheid en op affiniteitsconstante. Door temperatuur te verlagen,
kan reactiesnelheid trager verlopen maar ook sneller verlopen. Verlagen T° doet de affiniteit en
aviditeit voor een groot aantal immuunreacties toenemen. Bij sommige immunologische testen
(vb. Western blot) zal de herkenning van het Ag door de As specifieker verlopen wanneer er
gedurende lange tijd op lage temperatuur wordt geïncubeerd (overnacht bij 4°C) dan wanneer er
korter geïncubeerd wordt op kamertemperatuur

• Binding van een antigeen aan een vaste fase: De affiniteit wordt beïnvloed door de lokale
concentratie van antigeen. Een hoge lokale concentratie verhoogt de kans dat een antistof dat
loskomt van een antigeen opnieuw zal binden aan een aangrenzend antigeen. De binding van
een antigeen aan een vaste fase verhoogt de lokale concentratie en daardoor de
affiniteitsconstante.

• Vermindering van de oppervlaktespanning: wordt bekomen door detergentia toe te voegen (o.a.
Tween). Dit heeft een effect op de van der Waals krachten die zowel kunnen toenemen als
kunnen afnemen.

• Reactietijd: toename van de reactietijd doet van der Waalse krachten, waterstofbruggen en
hydrofobe-bindingen toenemen.

Waterontrekkende stoffen (zoals ammoniumsulfaat) en niet-ionische polymeren (zoals
polyethyleCoulenglycol (PEG)): verhogen de binding doordat ze een deel van het water
onttrekken aan de antigeen- en antistofmoleculen die daardoor in een kleiner volume
terechtkomen. De antigeen- en antistofmoleculen worden dus in een kleiner volume
geconcentreerd wat de reactiviteit verhoogt. Zoals eerder vermeld kan een antistof tegenover
één epitoop kruisreageren met een verschillend epitoop. In dat geval is de affiniteit van het
antistof voor het 2de epitoop geringer dan voor het oorspronkelijk epitoop. De antistoffen die
kruisreageren hebben een lage specificiteit



3

,De aviditeit
 Maat voor kracht van binding tss antistoffen in een antiserum en (multivalente) antigenen
 Samengesteld effect van affiniteit, aantal bindingsplaatsen (IgM > IgA > IgG) en testsysteem (suspensie
of vaste drager)
 Zo kan de associatieconstante Ka in de bovenstaande evenwichtsvergelijking aanzien worden als de
aviditeitsconstante voor een polyklonaal antiserum
 Voegt men monoklonalen samen dan zal de aviditeit van polyklonaal serum groter zijn dan de som
van de affiniteiten van de monoklonalen
 Er is dus een versterkingseffect van het polyklonaal serum

Door antigenen met meerdere epitopen te laten reageren met antistoffen met meerdere bindingsplaatsen kan men tot een
bijna irreversiebel immuuncomplex komen. De multivalente interacties kunnen toelaten dat antistoffen, die normaal een lage
affiniteit hebben, ook stabiele complexen vormen en dus een hoge aviditeit hebben. Omdat sommige technieken multimere
interacties meer toelaten dan andere zullen antistoffen (met anders een lage affiniteit) in sommige testen goed werken, terwijl
ze dit niet zullen doen in andere testen. Dit is bijvoorbeeld het geval wanneer een antigeen gebonden is aan een vaste fase
(immunoblotting, ELISA,...) (Figuur 3). De eerste binding van het antistof aan het geïmmobilizeerd antigeen wordt beïnvloed
door diffusie. De 2de binding kan echter sneller gaan omdat het antistof reeds in de nabijheid van het antigeen is. De hoge
lokale concentratie van het antigeen verhoogt de kans dat bij dissociatie van een bindingsplaats van een antistof met een
epitoop er snel terug binding optreedt. Dit alles resulteert in een hoge aviditeit. Door de verhoogde aviditeit kunnen
kruisreacties naar voor komen, terwijl ze niet of bijna niet aanwezig zijn in andere testen.




4

,Hoofdstuk 2: Aantonen antistoffen
 Deze testen kunnen onderverdeeld worden in:
o Precipitatietesten
o Agglutinatietesten of agglutinatie-inhibitietesten
o Complementbindingstesten
o Neutralisatietesten
o Ligandbindingstesten, waarbij het ligand gevormd wordt door een fluorescerende stof, een
enzym, een radio-isotoop, een metaal of een luminescerende stof

SOORT ASSAY MECHANISME TE KENNEN TESTEN
PRECIPITATIE Antistof bindt met oplosbaar Dubbele immunodiffusie
antigeen; vorming van zichtbaar
Radiale immunodiffusie
precipitaat
Immuno-elektroforese
Rocket-elektroforese
AGGLUTINATIE Antistof bindt met onoplosbaar Ringagglutinatie
antigeen in suspensie; vorming
Snelle agglutinatie (draagglaasje)
zichtbaar aggregaat
Trage agglutinatie (buisje)
Coombs test
Hemagglutinatie-inhibitie
COMPLEMENT- Antistof bindt met antigen met
BINDING complementactivatie tot gevolg;
Complementbindingstest
geen actief complement meer om
RBC te lyseren

NEUTRALISATIE Antistof bindt op bepaalde
antigenen van een microorganisme
of een toxine, waardoor
neutralisatie optreedt en het micro- Neutralisatietest
organisme of toxine geen effect
meer heeft in een gevoelige
gastheer
LIGANDBINDING Gemerkt ligand bindt aan Enzyme-Linked Immunosorbent Assays
antistof (ELISA)
Immunoblotting
Fluorescentie-immunoassay

 Deze testen tonen niet steeds dezelfde antistoffenfracties aan
 Zowel de immunoglobulineklasse kan verschillen als de fractie antistoffen

5

, Niet alle immunoglobulinenklassen bezitten dezelfde eigenschappen, voorbeelden:
o Precipitatiereactie kan enkel de precipiterende immunoglobulineklassen aantonen
o Neutralisatietest ken men van de IgG, IgM en IgA immunoglobulineklassen enkel de fractie
aantonen die neutralisatie veroorzaakt. Bepaalde fracties van de IgG, IgA en IgM immuno-
globulineklassen kunnen aan een micro-organisme binden zonder dit te neutraliseren (niet-
neutraliserende antistoffen) en worden dan ook niet opgespoord in een seroneutralisatietest
o In een complementbindingstest spoort men enkel complement-activerende immunoglobuline-
klassen op, namelijk IgG en IgM (zie verder)

IgG IgA IgM IgD IgE
Aantal monomeren 1 1-2 5 1 1
Sedimentatiecoëfficiënt (S) 6-7 7 19 7-8 8

Complementfixatie Ja(+) Neen Ja(++) Neen Neen

Agglutinatie Ja(+) Ja(+) Ja(++) Neen ? Neen
Precipitatie Ja(+) Ja(+) Ja(++) Neen ? Neen

Binding aan macrofagen Ja(+++) Neen Neen ? Neen Ja(+)

Binding aan neutrofielen Ja(+) Ja(+) Neen Neen Neen
Binding aan mastcellen Neen Neen Neen Neen Ja(++)

Antibacteriële activiteit Ja(+) Ja(+) Ja(++) ? ?

Antivirale activiteit Ja(+) Ja(+) Ja(+) ? ?



 De verhouding van immunoglobulineklassen (zoals IgM en IgG) en de affiniteit en aviditeit van
antistoffen tegenover een antigeen variëren afhankelijk van het tijdstip waarop het serum tijdens de
immuunrespons wordt verzameld:
o IgM-antistoffen komen vooral voor aan het begin van de humorale immuunrespons (primaire
immuunrespons). Serum verzameld tijdens deze vroege fase reageert beter in testen zoals
complementfixatie, agglutinatie en precipitatie
o IgG-antistoffen domineren in de secundaire immuunrespons
 Tijdens de primaire immuunrespons zijn de antistoffen gericht op immunodominante epitopen, maar
ze hebben vaak een lage affiniteit
 Toch kan de aviditeit hoog zijn, vooral voor IgM-antistoffen
 In de secundaire immuunrespons zijn de antistoffen gericht tegen minder dominante epitopen en
hebben ze een hogere affiniteit voor immunodominante epitopen
 Serologisch onderzoek detecteert antistoffen in serum, dat wordt verkregen door bloed te laten
stollen, gevolgd door centrifugatie om rode bloedcellen te verwijderen
 Langdurige opslag -> natriumazide (0,1%) toevoegen want inhibeert de werking van mitochondriën en
verstoort dus energie-metabolisme -> verhoging stabiliteit van het serum.
 Serum kan het best worden ingevroren bij –70°C om de afbraak van serumeiwitten door enzymen te
voorkomen
 Herhaald invriezen en ontdooien w vermeden, en serum mengen en centrifugeren na ontdooien

6

,2.1 Precipitatie
Algemeen principe
 Bij precipitatiereacties probeert men antistoffen (of antigenen) aan te tonen door een onoplosbaar
immuuncomplex te genereren tussen Ag en As
 Op basis van het verschijnen van een neerslag wordt beoordeeld of het staal antistoffen bevat of niet
 De reactie tss een multivalent antigeen en immunoglobulinen: 3 fasen
1) In de eerste fase gebeurt de binding van één epitoop aan één bindingsplaats waarbij een
oplosbaar antigeen-antistof-complex ontstaat.
2) In de tweede fase worden van deze primair gevormde oplosbare complexen grotere aggregaten
gevormd.
3) In de derde fase kunnen deze als onoplosbaar precipitaat neerslaan.

 Precipitatie treedt alleen op bij een ideale verhouding tussen antigeen en antistoffen
 Bij een optimale verhouding vormen antistoffen ( hebben minimaal twee bindingsplaatsen) met
antigenen een onoplosbaar netwerk dat neerslaat (precipitatiereactie)
 Verhouding niet optimaal (bv: overmaat aan antigeen of antistof) ontstaat er weinig of geen
precipitaat
 Kan leiden tot vals negatief resultaat, waarbij ten onrechte wordt geconcludeerd dat er geen
antistoffen aanwezig zijn
 Prozone effect = geringe/afwezigheid van precipitatie die men bekomt in een zone van antigeen- of
antistof-overmaat. Men krijgt een vals negatief resultaat.
 Goed oplosbare eiwit-antigenen (40.000 tot 60.000 Dalton) zijn grenzen voor antigeen-
antistofverhouding nauwkeurig
 Bij slecht oplosbare antigenen verder uit elkaar liggen
 Een antigeen met slechts één epitoop kan geen precipitatiereactie veroorzaken
 Monoklonale antistoffen resulteren in minder goede precipitatie, en sommige klassen, zoals IgE, zijn
niet precipiterend.
 De precipitatiereactie is gevoelig voor pH, temperatuur en ionensterkte, en zowel affiniteit als aviditeit
zijn belangrijk
 Reacties kunnen in vloeibaar medium of gel plaatsvinden, met verschillende uitvoeringsmethoden




7

,IMMUNOPRECIPITATIE VOORAFGAANDE MEDIUM PRECIPITATIETEST




Tabel 3: Immunologische testen waarbij precipitatie gebeurt


Precipitatiereacties in vloeibaar medium
 Deze reacties vertonen zeer veel overeenkomst met de agglutinatiereacties in vloeibaar medium
 Behalve nefelometrie en turbidometrie w precipitatiereacties in vloeibaar medium weinig gebruikt

Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese
 De gel wordt gemaakt door agar in een buffer te suspenderen
 Agar zorgt dat er een stabiele waterige fase ontstaat zonder een mechanische of elektrische stroom
 Agar is een uit zeewier verkregen polysacharide met een negatieve lading (door sulfaationen)
 De waterige fase van de gel is positief geladen
 Wnr agar stolt, vormt het in de gel een netwerk met een poriëngrootte die bepaald wordt door de
concentratie van de agar in de gel
 Een lagere concentratie van de agar geeft grotere poriën
 De moleculen die kleiner zijn dan de poriën kunnen ongehinderd in de gel diffunderen
 Grote moleculen zoals immunoprecipitaten worden vastgehouden in het netwerk van de gel

A. De dubbele immunodiffusie volgens Ouchterlony
 Hier worden gaatjes in gel gemaakt, waarna antigeen en antiserum uit tegenoverliggende gaatjes naar
elkaar toe diffunderen
 Naarmate ze verder diffunderen, neemt hun concentratie af
 Bij een optimale verhouding van antigeen en antistof ontstaat een zichtbaar precipitaat in de gel, de
precipitatielijn, die eventueel door eiwitkleuring versterkt kan worden
 Deze techniek wordt ook agargelprecipitatietest (AGP) genoemd
 De positie van de precipitatielijn w beïnvloed door diffusiecoefficiënten, beginconcentraties, pH en T°
8

,  De diffusie duurt vaak 1 dag of langer voor afstanden van 5-20 mm
 Bij een specifieke antiserumconcentratie geldt: hoe lager de antigeenconcentratie, hoe dichter de
precipitatielijn bij het antigeengaatje ligt, en vice versa
 De lijnen kunnen drie resultaten tonen:
o Identiteit: lijnen overlappen volledig
o Non-identiteit: lijnen kruisen elkaar
o Partiële identiteit: er treedt spoorvorming op bij gemeenschappelijke determinanten
 De gevoeligheid kan worden verhoogd met radioactief gemerkte immunoglobulinen en autoradiografie

B. De radiale immunodiffusie
 = Kwantitatieve test waarbij het antiserum (antistoffen) gelijkmatig wordt vermengd met de agar in de gel
 In de gel w gaatjes gmkt, waarna antigeenoplossing in een gaatje w gebracht en vanuit daar diffundeert
 De concentratie van het antigeen daalt naarmate het verder diffundeert
 Wanneer de concentratie van het antigeen in balans is met de constante antistofconcentratie, vormt zich
een precipitatiereactie zichtbaar als een ring
 De diameter van de ring correleert positief met de log van de antigeenconcentratie
 Bij voltooiing van de reactie is er een positieve correlatie tss de ringoppervlakte en antigeenconcentratie
 Hoe groter de ring, hoe hoger de antigeenconcentratie
 Vanwege variaties (5-10%) worden standaard-oplossingen gebruikt voor het maken van een ijkcurve,
waarmee de resultaten van testmonsters worden vergeleken.
 Nadeel: verschillen in molecuulgrootte (zoals aggregaten van IgG) beïnvloeden de ringdiameter sterk
 De gevoeligheid kan worden verhoogd door de antiserumconcentratie te verlagen, waardoor grotere
ringen ontstaan, of door het antiserum radioactief te merken, zoals bij dubbele immunodiffusie.

Precipitatiereacties in gel in aanwezigheid van elektroforese
A. Principe van de elektroforese
 Elektroforese van eiwitten berust op het feit dat in een oplossing van een bepaalde pH de eiwitten
onderling verschillende elektrische ladingen hebben
 Dit maakt het mogelijk de eiwitten onder invloed van een elektrisch veld van elkaar te scheiden
 De lading van een eiwit in een buffer hangt af van het isoelektrisch punt en van de pH van de buffer
 Isoelektrisch punt wordt bepaald door het aantal -COOH groepen en het aantal -NH2 groepen in het eiwit
 De elektroforese gebeurt meestal in een barbituraatbuffer met pH 8,6
 Meeste antigenen hebben isoelektrisch punt lager dan 7,5 en zijn bij deze pH dan ook negatief geladen
 Ze zullen dus naar de positieve pool (anode) migreren
 Uitzondering: gammaglobulinen die positief geladen zijn en naar de negatieve pool (kathode) migreren.

B. Immuno-elektroforese
 Combinatie van elektroforese en immunodiffusie
 Eerst w de antigenen in een oplossing gescheiden door elektroforese zoals hierboven beschreven
 Antigenen met een positieve lading in de buffer zullen naar de negatieve pool migreren en andersom
 Na de elektroforese voert men een immunodiffusie uit
 Het antiserum wordt in een geul evenwijdig met de elektroforese richting gebracht
 Er ontstaat spontane diffusie van antigeen en antistof en op de plaats van optimale verhouding tussen
beide ontstaat er een precipitatielijn
 De test wordt steeds uitgevoerd ten opzichte van een referentieantigeen
9