Samenvatting scheidingstechieken en eiwitzuivering

Samenvatting scheidingstechnieken en eiwitzuivering
Hoofdstuk 1: Inleidende begrippen................................................................................2
1.1 Soorten scheidingstechnieken..............................................................................2
1.2 Chromatografie.....................................................................................................2
Hoofdstuk 2: Uitwisselingsprincipes..............................................................................6
2.1 Adsorptiechromatografie......................................................................................6
2.2 Verdelingschromatografie....................................................................................7
2.3 Ionenuitwisselingschromatografie......................................................................10
2.4 Affiniteitschromatografie....................................................................................15
2.5 Gelfiltratiechromatografie..................................................................................18
2.6 Hydrofobe interactiechromatografie..................................................................20
Hoofstuk 3: Staalvoorbereiding...................................................................................23
3.1 Staal voorbereiden op extractie.........................................................................24
3.2 Extractie.............................................................................................................24
3.3 Derivatisatie.......................................................................................................27
3.4 Standaardisatie...................................................................................................29
3.5 Staalvoorbereiding voor eiwitopzuivering..........................................................31
Hoofstuk 4: Chromatografie.........................................................................................34
4.1 Papierchromatografie.........................................................................................34
4.2 Dunnelaagchromatografie..................................................................................34
4.3 Theoretische aspecten van verdelingschromatografie......................................39
4.4 Kolomchromatografie.........................................................................................42
4.4.2 Gaschromatografie.......................................................................................44
4.4.3 Vloeistofchromatografie...............................................................................50
Hoofstuk 5: detectiemethoden....................................................................................59
Hoofstuk 6: methode-validatie.....................................................................................61




1

, Hoofdstuk 1: Inleidende begrippen
1.1 Soorten scheidingstechnieken
- scheidingstechnieken met scheidingsprincipe waarop ze gebaseerd zijn
 Filtratie: verschil in deeltjesgrootte
 Extractie: verschil in oplosbaarheid
 Destillatie: verschil in kookpunt
 Indampen: verschil in kookpunt
 Centrifugeren/decanteren: verschil in massadichtheid
 Elektroforese: verschillen in elektroforetische mobiliteit van deeltjes




- Chromatografie  veelzijdige en krachtige scheidingstechniek die verdere
identificatie en kwantificatie van hele reeks belangrijke componenten mogelijk
maakt
 de scheiding van de componenten gebaseerd op hun verschil in
oplosbaarheid, grootte, polariteit, adsorptie of vluchtigheid
- preparatief
 isolatie van doelwitcomponent of analyt
 Recuperatie doelwitcomponent in zuivere vorm
 Vb zuivere aspirine uit ruw reactiemengsel
 Vaak met grote hoeveelheden
- Analytisch
 Enkel informatie over doelwitcomponent: kwalitatief en kwantitatief
 Geen recuperatie van doelwitcomponent
 Vb geneesmiddelen in bloed
 Vaak met heel kleine hoeveelheden
- scheidingstechniek  methode om zuivere verbindingen te verkrijgen uit
mengsel van stoffen
 Zuivere verbindingen = doelwitcomponenten = analyten

1.2 Chromatografie
- Chromatografie
 Scheidingstechniek die gebruik maakt van 2 niet-mengbare fasen:
 Mobiele Fase (MF): gas of vloeistof die voortbeweegt
 (mengsel van) polaire of apolaire solventen
 Gas: N2, H2
 Stationaire Fase (SF): vaste stof of vloeistof die stilstaat
 Silicagel (polaire fase)
 Gemodificeerde silicagel (apolaire fase)
 Drager met daarop gebonden groepen: enzymstubstraten,
antilichamen, …
 Drager met poriën van bepaalde grootte
 Vloeistof
- Werking:


2

,  Mengsel (staal) oplossen en op stationaire fase brengen
 Mobiele Fase stroomt langs/doorheen SF
 interactie tussen componenten van het staal en de SF én MF
 enkel als component in MF migreert  component stroomt mee
 Componenten met verschillende wisselwerking met SF en MF zullen
met verschillende snelheid migreren
 scheiding van componenten
- Doelstelling chromatografie
 scheiden van mengsel in zijn individuele componenten (+
detectiesysteem)
 kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van opgezuiverde
verbinding(en)
 = analytische chromatografie
 opgezuiverde verbinding(en) te isoleren
 = preparatieve chromatografie
- Dunnelaagchromatografie DLC/ TLC
 stationaire fase
 meestal vaste fase silicagel en aluminiumoxide
 vloeibare fase  cellulosepoeder met waterlaag
 dunne laag op vlakke glas-, aluminium- of kunststofplaat
 mobiele fase  eluens
 organisch solvent of mengsel van solventen
 mobiele fase beweegt door capillaire krachten over stationaire
fase
 figuur:
 oplossing van mengsel met 2 componenten
rood en blauw gespot op dunnelaagplaat
 in ontwikkelingskamer verzadigd met eluens
geplaatst
 eluens migreert langs dunnelaagplaat door capillaire krachten
 blauw  grotere affiniteit voor staionaire fase  sterker
vastgehouden dan rood
 Rood  sneller bewegen  mengsel gescheiden
 Retentiefactor Rf
 ratio to front  verhouding van loopafstand van
component ten opzichte van loopafstand van
mobiele fase
 retentiefactor  tussen 0 en 1
 Hoe minder affiniteit component heeft voor SF, hoe
verder analyt in bepaalde tijd migreert op plaat  hoe groter
retentiefactor is
- Kolomchromatografie
 kolommen  buisjes gevuld met stationaire fase
 waardoor mobiele fase stroomt
 passage van mobiele fase doorheen kolom elutie
 mobiele fase  eluens of eluent
 mobiele fase na chromatografische scheiding kolom
verlaateluaat




3

,  figuur
 oplossing van mengsel met 2
componenten rood en blauw,
aangebracht bovenop kolom
 verbindingen rood en blauw
verschillende affiniteit voor stationaire-
en/ of mobiele fase migreren met verschillende snelheid in
kolom
 Vers eluent steeds opnieuw aangebracht bovenop kolom
waardoor mengsel verder migreert
 blauw sterker vastgehouden door vaste fase dan component
rood  blauw zal minder tijd in mobiele fase doorbrengen dan
rood
 blauw trager doorheen kolom bewegen dan rood  pas
onderaan kolom nadat rood is geëlueerd  mengsel gescheiden
 concentratie van componenten
 in functie van afstand afgelegd in kolom
op vier verschillende tijdstippen
 Pas op tijdstip (d) zijn componenten
volledig van elkaar gescheiden
 stoffen die grotere afstand afleggen
vergroot bandbreedte waar component zicht bevindt
- Chromatogram
 chromatogram verband tussen detectorsignaal en tijd die verloopt
vanaf start van scheiding
 plaats van piek in chromatogram aanwijzing over aard van stof
 oppervlak van piek hoeveelheid stof
 basis daarvan kan kwalitatieve en kwantitatieve analyse plaatsvinden
 Uit chromatogram  belangrijke parameters:
 dode tijd = mobiele tijd = tm = t0 = holdup time
 tijd die onvertraagde component in mobiele fase nodig
heeft om door kolom te stromen
 tijd die mobiele fase nodig heeft om door de kolom te
stromen
 Retentietijd tr
 tijd die verloopt tussen begin van scheiding (injectie van
staal) en verschijnen van piekmaximum
 mobiele fase met constante snelheid u door kolom
stroomt  retentievolume Vr = tr . u
 baseline width, w
 breedte van piek gemeten aan basis,
 bepaald door hellingen van piek te extrapolleren tot
basislijn
 oppervlakte onder piek = piekoppervlakte, AUC, area under the
curve = peak area,
 Hoeveelheid stof
 resolutie; Rs
 tussen twee pieken  mate waarin stoffen gescheiden
worden gedurende looptijd
 resolutie tussen twee pieken berekend door verschil in
retentietijd te delen door gemiddelde breedte van twee
pieken aan basis:


4