Samenvatting CW
Celine Uitendaal
Hoorcollege 1 – microscopie
1
,Lichtmicroscoop (resolutie 200 nm):
1. Bright field microscoop
o Licht wordt gegenereerd in een lichtbron bij de basis van de
microscoop. De hoeveelheid licht kan worden gereguleerd door een
dimknop.
o Het licht passeert door een condenser lens. Deze condenserlens
focust het licht op het glasplaatje erboven, die het sample bevat, om
de verlichting te maximaliseren.
o De hoeveelheid licht dat passeert door het sample kan verder worden
aangepast door de breedte van het diafragma aan te passen.
o Licht van verschillende golflengtes buigen in verschillende hoeken,
dus wanneer objecten meer worden vergroot, worden de beelden minder
verschillend. Bij kleine vergrotingen is dit niet te zien, maar
wanneer je de 100x objectieflens gebruikt en lucht verplaatst voor
immersieolie met een refractieindex die gelijk staat aan die van
het glasplaatje, krijg je een nog helder beeld.
o Lucht en olie tussen de objectieflens en het glasplaatje worden
ook wel het medium waar het licht door passeert genoemd.
o De objectieflens verzamelt het licht en passeert het naar de
oculair lens binnen het ooggedeelte. De oculairlens voegt een andere vergroting
toe (meestal 10-12x) en projecteert het beeld op het oog van de
persoon die de microscoop gebruikt.
2. Fase-contrast microscoop
o Wordt gebruikt o.a. voor het bestuderen van levende ongekleurde
cellen.
o Achtergrondbelichting wordt gescheiden van het door het object
verstrooide licht.
3. Fluorescentie-microscoop
o Voor detectie specifieke moleculen.
o Fluorofoor (chemische stof die fluorescentie vertoont) kan
direct of indirect aan een specifiek molecuul worden gekoppeld.
o Geschikt voor lokalisatie van die specifieke moleculen, ook in
zeer kleine structuren.
o Kunt meerdere fluorescenten tegelijk gebruiken.
o Is toepasbaar op zowel gefixeerde als op levende cellen.
2
, o Met een fluorescentiemicroscoop ga je een object belichten met monochroom
licht, dat kan gemaakt worden door een UV-lamp of door een laser.
o Dan wordt licht van één bepaalde golflengte door een filter gelaten en via de
spiegel geprojecteerd op het object.
o Als er fluorescente moleculen zitten, zullen ze die quantum van het
monochrome licht absorberen (ze kunnen maar één bepaalde
golflengte absorberen) en zullen dan een golflengte of een quant van
een andere golflengte (met een langere golflengte en dus minder
energie) teruggeven door een tweede filter. Die golflengte vang je dan
selectief op op een filter, en projecteer je op je oog.
o Om de moleculen fluorescent te maken wordt er vaak gebruik gemaakt
van antilichamen: wanneer je in een zoogdier een antigen inspuit, wordt dat stofje
als lichaamsvreemd gezien. De B-cellen van het organisme gaan in reactie hierop
antilichamen maken die op dit antigen passen.
▪ Die antilichamen kun je daarna isoleren uit het bloed, en gebruiken voor
bijvoorbeeld de labelling van cellen (policlonale antilichamen)
o In sommige gevallen wil je maar één type antilichaam, een zogenaamd
monoclonaal antilichaam.
▪ Je injecteert een dier met een antigen.
▪ Die gaat in de milt B-cellen maken en vermenigvuldigen die passen op het
antigen (dit zijn de policlonale antilichamen).
▪ Je pakt één B-cel en die fuseer je met een myeloma cel (tumorcel die
onbegrensd kan delen).
▪ Het fusieproduct kan dus onbeperkt delen en maakt maar één type
antilichaam. Dit is een monoclonaal antilichaam.
o Die antilichamen ga je vervolgens fluorescent maken, en daar kun je cellen mee
labellen.
▪ Je pakt weefsel en gaat het fixeren.
▪ Je maakt de cel lek door een beetje zeep toe te voegen, de antilichamen
kunnen naar binnen.
▪ Als het antilichaam binnen is kan het daar binden waar het antigen zich
bevindt.
▪ Alle overbodige, ongebonden antilichamen was je weg.
o Er wordt vaak gebruikt gemaakt van reporter genes om bepaalde eiwitten te
volgen in levende cellen. Dit zijn eiwitten die kunnen worden geregistreerd door
hun fluorescentie of enzymatische activiteit.
▪ Eén van de populairste reporter genes is green fluorescent protein (GFP).
Wanneer het gen dat codeert voor GFP bindt aan de regulerende
volgordes van een gen naar interesse, kan de expressie van het
resulterende reporter gen worden geregistreerd door
fluorescentiemicroscopie.
Elektronenmicroscoop:
- Wordt gebruikt om de structuur van weefsels, cellen en moleculen te bestuderen.
- Gebruikt elektronen ipv fotonen.
- De resolutie van een elektronenmicroscoop is veel beter dan die van lichtmicroscopen,
omdat de golflengte van een elektron 100.000 keer korter is dan die van lichtfotonen.
- Elektronenmicroscopen produceren grijze beelden met helderheidswaardes per pixel.
- De elektronenstroom wordt geproduceerd door een kathode als de elektronenbron,
versneld door een anode, en gefocust door elektromagnetische lenzen.
3
, - Er zijn twee hoofdtypen elektronenmicroscopen.
1. Transmissie elektronen microscopen (TEM)
o Hierin worden elektronen verzonden door het exemplaar.
o Is een beetje hetzelfde als een lichtmicroscoop, alleen in plaats van fotonen
gebruikt het elektronen, en in plaats van glaslenzen focussen magnetische
spoelen de stroom.
o Een elektronenpistool vuurt een stroom van elektronen.
o Deze stroom wordt gefocust door een elektromagnetische lens (magnetische
spoel).
o De stroom van elektronen passeert het sample, die de elektronen in een
specifiek patroon verstrooid. Afhankelijk van de aanwezigheid van zware
metalen in het sample kunnen sommige elektronen uit de stroom worden
verstrooid. Dus de elektronenstroom draagt informatie over de lokale
dichtheden van zware metalen.
o De structuur van het onderwerp wordt vergroot door een
elektromagnetische objectieflens.
o Het vergrootte elektronenbeeld passeert een projectorlens, om op
een fluorescent scherm te worden geprojecteerd, of direct te worden
opgenomen door een camera.
o Dit beeld kan worden gezien op een kijkscherm of op film.
o Omdat de elektronen in een TEM door het onderwerp heen gaan, zal
het uiteindelijke beeld informatie laten zien van de volledige sectie.
2. Scanning elektronen microscopen (SEM)
o De elektronen passeren niet door het onderwerp. In plaats daarvan
worden ze verstrooid over het oppervlak van het sample en is het
deze emissie die wordt gedetecteerd en vertaald tot een digitaal
beeld. Snijden van het sample is dus niet nodig.
o Een elektronenpistool vuurt een stroom elektronen.
o De elektronenstroom wordt gefocust door een elektromagnetische
lens (scannende spoelen) om elk punt van het oppervlak succesvol
te raken.
o Het hele oppervlak is bedekt met een metaal, die op het sample is
gestort door ofwel laag-vacuum sputter coating of door hoog-
vacuum verdamping.
o Wanneer de stroom interactie aangaat met het oppervlak van het
onderwerp, worden hoge-energie elektronen terugverstrooid en lage-
energie secundaire elektronen uitgezonden, afhankelijk van de lokale
hoek.
o De hoeveelheid van verstrooide of uitgezonden elektronen wordt
gemeten door een detector, die een beeld op een videoscherm
genereert.
o Het scannen van het object in een raster modus zorgt voor variërende
intensiteiten die weer zorgen voor informatie voor punt per punt
beeldvorming.
o Het videoscherm ontvangt ook input van scannende spoelen, hoger in de
microscoop.
o Het beeld laat alleen het oppervlak van het sample zien, aangezien de elektronen
niet door het hele onderwerp zijn gepasseerd.
Resolutie: op welke afstand twee verschillende structuren in een sample nog steeds kunnen worden
onderscheiden als verschillende structuren in het gegenereerde beeld. De resolutie van een bright-
field microscoop is veel lager dan de resolutie van een elektronenmicroscoop.
4
Celine Uitendaal
Hoorcollege 1 – microscopie
1
,Lichtmicroscoop (resolutie 200 nm):
1. Bright field microscoop
o Licht wordt gegenereerd in een lichtbron bij de basis van de
microscoop. De hoeveelheid licht kan worden gereguleerd door een
dimknop.
o Het licht passeert door een condenser lens. Deze condenserlens
focust het licht op het glasplaatje erboven, die het sample bevat, om
de verlichting te maximaliseren.
o De hoeveelheid licht dat passeert door het sample kan verder worden
aangepast door de breedte van het diafragma aan te passen.
o Licht van verschillende golflengtes buigen in verschillende hoeken,
dus wanneer objecten meer worden vergroot, worden de beelden minder
verschillend. Bij kleine vergrotingen is dit niet te zien, maar
wanneer je de 100x objectieflens gebruikt en lucht verplaatst voor
immersieolie met een refractieindex die gelijk staat aan die van
het glasplaatje, krijg je een nog helder beeld.
o Lucht en olie tussen de objectieflens en het glasplaatje worden
ook wel het medium waar het licht door passeert genoemd.
o De objectieflens verzamelt het licht en passeert het naar de
oculair lens binnen het ooggedeelte. De oculairlens voegt een andere vergroting
toe (meestal 10-12x) en projecteert het beeld op het oog van de
persoon die de microscoop gebruikt.
2. Fase-contrast microscoop
o Wordt gebruikt o.a. voor het bestuderen van levende ongekleurde
cellen.
o Achtergrondbelichting wordt gescheiden van het door het object
verstrooide licht.
3. Fluorescentie-microscoop
o Voor detectie specifieke moleculen.
o Fluorofoor (chemische stof die fluorescentie vertoont) kan
direct of indirect aan een specifiek molecuul worden gekoppeld.
o Geschikt voor lokalisatie van die specifieke moleculen, ook in
zeer kleine structuren.
o Kunt meerdere fluorescenten tegelijk gebruiken.
o Is toepasbaar op zowel gefixeerde als op levende cellen.
2
, o Met een fluorescentiemicroscoop ga je een object belichten met monochroom
licht, dat kan gemaakt worden door een UV-lamp of door een laser.
o Dan wordt licht van één bepaalde golflengte door een filter gelaten en via de
spiegel geprojecteerd op het object.
o Als er fluorescente moleculen zitten, zullen ze die quantum van het
monochrome licht absorberen (ze kunnen maar één bepaalde
golflengte absorberen) en zullen dan een golflengte of een quant van
een andere golflengte (met een langere golflengte en dus minder
energie) teruggeven door een tweede filter. Die golflengte vang je dan
selectief op op een filter, en projecteer je op je oog.
o Om de moleculen fluorescent te maken wordt er vaak gebruik gemaakt
van antilichamen: wanneer je in een zoogdier een antigen inspuit, wordt dat stofje
als lichaamsvreemd gezien. De B-cellen van het organisme gaan in reactie hierop
antilichamen maken die op dit antigen passen.
▪ Die antilichamen kun je daarna isoleren uit het bloed, en gebruiken voor
bijvoorbeeld de labelling van cellen (policlonale antilichamen)
o In sommige gevallen wil je maar één type antilichaam, een zogenaamd
monoclonaal antilichaam.
▪ Je injecteert een dier met een antigen.
▪ Die gaat in de milt B-cellen maken en vermenigvuldigen die passen op het
antigen (dit zijn de policlonale antilichamen).
▪ Je pakt één B-cel en die fuseer je met een myeloma cel (tumorcel die
onbegrensd kan delen).
▪ Het fusieproduct kan dus onbeperkt delen en maakt maar één type
antilichaam. Dit is een monoclonaal antilichaam.
o Die antilichamen ga je vervolgens fluorescent maken, en daar kun je cellen mee
labellen.
▪ Je pakt weefsel en gaat het fixeren.
▪ Je maakt de cel lek door een beetje zeep toe te voegen, de antilichamen
kunnen naar binnen.
▪ Als het antilichaam binnen is kan het daar binden waar het antigen zich
bevindt.
▪ Alle overbodige, ongebonden antilichamen was je weg.
o Er wordt vaak gebruikt gemaakt van reporter genes om bepaalde eiwitten te
volgen in levende cellen. Dit zijn eiwitten die kunnen worden geregistreerd door
hun fluorescentie of enzymatische activiteit.
▪ Eén van de populairste reporter genes is green fluorescent protein (GFP).
Wanneer het gen dat codeert voor GFP bindt aan de regulerende
volgordes van een gen naar interesse, kan de expressie van het
resulterende reporter gen worden geregistreerd door
fluorescentiemicroscopie.
Elektronenmicroscoop:
- Wordt gebruikt om de structuur van weefsels, cellen en moleculen te bestuderen.
- Gebruikt elektronen ipv fotonen.
- De resolutie van een elektronenmicroscoop is veel beter dan die van lichtmicroscopen,
omdat de golflengte van een elektron 100.000 keer korter is dan die van lichtfotonen.
- Elektronenmicroscopen produceren grijze beelden met helderheidswaardes per pixel.
- De elektronenstroom wordt geproduceerd door een kathode als de elektronenbron,
versneld door een anode, en gefocust door elektromagnetische lenzen.
3
, - Er zijn twee hoofdtypen elektronenmicroscopen.
1. Transmissie elektronen microscopen (TEM)
o Hierin worden elektronen verzonden door het exemplaar.
o Is een beetje hetzelfde als een lichtmicroscoop, alleen in plaats van fotonen
gebruikt het elektronen, en in plaats van glaslenzen focussen magnetische
spoelen de stroom.
o Een elektronenpistool vuurt een stroom van elektronen.
o Deze stroom wordt gefocust door een elektromagnetische lens (magnetische
spoel).
o De stroom van elektronen passeert het sample, die de elektronen in een
specifiek patroon verstrooid. Afhankelijk van de aanwezigheid van zware
metalen in het sample kunnen sommige elektronen uit de stroom worden
verstrooid. Dus de elektronenstroom draagt informatie over de lokale
dichtheden van zware metalen.
o De structuur van het onderwerp wordt vergroot door een
elektromagnetische objectieflens.
o Het vergrootte elektronenbeeld passeert een projectorlens, om op
een fluorescent scherm te worden geprojecteerd, of direct te worden
opgenomen door een camera.
o Dit beeld kan worden gezien op een kijkscherm of op film.
o Omdat de elektronen in een TEM door het onderwerp heen gaan, zal
het uiteindelijke beeld informatie laten zien van de volledige sectie.
2. Scanning elektronen microscopen (SEM)
o De elektronen passeren niet door het onderwerp. In plaats daarvan
worden ze verstrooid over het oppervlak van het sample en is het
deze emissie die wordt gedetecteerd en vertaald tot een digitaal
beeld. Snijden van het sample is dus niet nodig.
o Een elektronenpistool vuurt een stroom elektronen.
o De elektronenstroom wordt gefocust door een elektromagnetische
lens (scannende spoelen) om elk punt van het oppervlak succesvol
te raken.
o Het hele oppervlak is bedekt met een metaal, die op het sample is
gestort door ofwel laag-vacuum sputter coating of door hoog-
vacuum verdamping.
o Wanneer de stroom interactie aangaat met het oppervlak van het
onderwerp, worden hoge-energie elektronen terugverstrooid en lage-
energie secundaire elektronen uitgezonden, afhankelijk van de lokale
hoek.
o De hoeveelheid van verstrooide of uitgezonden elektronen wordt
gemeten door een detector, die een beeld op een videoscherm
genereert.
o Het scannen van het object in een raster modus zorgt voor variërende
intensiteiten die weer zorgen voor informatie voor punt per punt
beeldvorming.
o Het videoscherm ontvangt ook input van scannende spoelen, hoger in de
microscoop.
o Het beeld laat alleen het oppervlak van het sample zien, aangezien de elektronen
niet door het hele onderwerp zijn gepasseerd.
Resolutie: op welke afstand twee verschillende structuren in een sample nog steeds kunnen worden
onderscheiden als verschillende structuren in het gegenereerde beeld. De resolutie van een bright-
field microscoop is veel lager dan de resolutie van een elektronenmicroscoop.
4
