INLEIDING (1)
Methoden in biomedisch onderzoek
Kernthema’s van methoden 3
Van één (enkele) molecule(n) naar omics
▪ Next generation sequencing
▪ Massive parallel sequencing
▪ Nanopore sequencing
Multi-omics = data bij elkaar brengen om een compleet beeld te krijgen
Van ‘bulk’ naar ‘single cell’
▪ Bulk analyse = weefsel nemen, in mixer steken en zo alle klassen van moleculen nagaan
Output is gemiddelde van volledige weefsel
└ Vb. spatiale transcriptomics om na te gaan welk transcript op welke plaats & zo
verschillende celtypes zien
▪ Single cell analyse = cellen uit weefsel halen en omics doen op single cellen
Ruimtelijke informatie verloren
└ Vb. single cell transcriptomics om cellen uit elkaar te halen en te mappen
Interactomics = interacties tussen moleculen nagaan
Pathway analyse en fluxomics
▪ Via merkersubstraat (vb. C13 gemerkt glucose) volgen wat er gebeurt & zien hoe het
metabolisme is veranderd in een bepaalde ziekte
Genmodulatie = aantonen dat gen rol speelt in ziekte door gen te veranderen
1
,2
, DNA (2)
A: DNA SEQUENTIEBEPALING
methoden:
1) first-generation sequencing
o bulk sequencen
o Sanger, cloneren & elektroforese
o gouden standaard voor kleine projecten
2) second- / next-generation sequencing
o massief parallel sequencen ( miljoenen tegelijk)
o via clonaal geamplificeerde DNA moleculen
o bv ilumina
3) third- / next-next-generation sequencing
o individuele DNA moleculen sequencen zonder eerst amplificeren
o bv nanopore
➔ evolutie in capaciteit, snelheid en kosten
toepassingen:
▪ de novo genoom sequentiebepaling
ongekende genomen, nieuwe organismen ( bv Sars-CoV-2)
gedeeltelijk of volledig
in stukken gebeuren, dan kijken naar overlaps & vervolgens aan elkaar hangen
bv: humaan genoom project
▪ resequencing
mutaties = zeldzame veranderingen gelinkt aan ziektes
verschillen tussen individuen (SNPs)
referentiegenoom voor nieuwe individuen
gekend genoom van organisme
▪ sequentiebepaling als teller
aantallen DNA of RNA moleculen bepalen als teller
weten hoe vaak bepaald gen tot expressie komt in bepaald weefsel
RNAseq, ChiPseq,…
3
,1: 1ste generatie sequentiebepaling
Maxam & Gilbert
principe:
▪ differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties
▪ dan scheiding op gel volgens grootte
▪ dan visualisatie via autoradiografie
korte fragmenten
niet helemaal specifiek
werking:
analyse van de radio-actieve bandjes met de korte fragmentjes onderaan en de lange bovenaan.
Letter G boven de rij omdat enkel daar de bandjes een kleur geven. A & G omdat ze op die positie een
kleur geven.
4
,Sanger sequencing= dideoxy-keten terminatiemethode
principe:
▪ template/matrijs
: gefragmenteerd genoom geamplificeerd door kloneren / specifiek fragment geamplificeerd
door PCR
▪ polymerase + primer + mengsel 4 dNTPs + ddNTPs, elk met ander fluorescent label
▪ reactie loopt na inbouwen dNTP & stopt na inbouwen ddNTP
▪ !! verhouding dNTPs/ddNTPs
▪ Scheiden strengen: gel of capillair : elektroferogram
▪ 1 streng per keer aflezen
▪ 2 reacties voor betrouwbaarheid (FW en RV primer) = beide richtingen aflezen
beperkt tot 500 bp
moeite met herhalingen
Groen template: via polymerase maak je nieuwe DNA dat vertrekt vanuit een primer.
4dNTP’s & kleine hoeveelheid ddNTP’s. waarom dd? DNA is altijd deoxy ( zuurstof minder). Di omdat
er een H staat i.p.v. een OH. Aan de O kan er niets gebonden worden waardoor de reactie wel door kan
gaan.
▪ kwaliteitsscores = Phred score
o -10log10(P)
o 1ste 30 bp niet afleesbaar
o Meestal 500-700 bp goede sequentie afleesbaar
o P = probabiliteit van foutieve base call
o als Q=30 ⇒ 1/1000 kans op een fout
5
,verwezenlijkingen met 1ste generation sequencing:
a) human genome project (HGP)
~ grootste multinationale biologisch project ooit
~ stalen meerdere anonieme individuen
~ methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode
~ clones in YACs, BACs, P1s en cosmiden
1) mapping & fragmentatie
2) automatische sample bereiding & sequentiebepaling
3) elke 24u publieke vrijgave sequenties
4) draft sequentie 2001
5) finale sequentie 2003
b) human genome sequencing door Celera
~ Door Craig Venter
~ Stalen van 5 individuen
~ Methode: whole genome shotgun sequencing
~ Draft sequentie 2001
Enorme impact op
▪ Technologische ontwikkeling van sequencing
▪ Grote ontwikkeling van bioinformatica
▪ Visie op delen van data
▪ Andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
▪ Biologische kennis
Nieuwe uitdagingen
▪ Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
▪ Meer genomen sequencen van meerdere species
▪ Meer individuele humane sequenties
▪ Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
▪ Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
▪ Farmacogenomics verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren
op geneesmiddelen
▪ Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
▪ Therapie op maat
Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten → andere technologie
nodig met hoge capaciteit en lage kosten
6
,2: 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation sequencing
doel:
▪ veel hogere throughput aan veel lagere kosten ⇒ massale DNA sequentiebepaling mogelijk
▪ richtdoel: 1 humaan genoom op toestel per dag voor < 1000USD
Voordelen Nadelen
Snelheid Read lengte 35-700 bp (<sanger)
Kost Throughput geeft grote absolute hoeveelheid fouten
Accuraatheid: 85 – 99.9%
Weinig input nodig
Drie technieken van sequencing:
1) WGS whole genome sequencing
2) WES whole exome sequencing
3) targetted sequencing (specifieke gewenste regio’s)
Ontwikkeling van SGS met 3 pijlers:
▪ parallelle detectie = massieve parallel sequencing
cluster/ polony = kopieën van DNA template die ruimtelijk dicht bij elkaar liggen
klonale in vitro amplificatie van template
: duizenden-milj kkopieën van DNA template per cluster
multiplexing = veel clusters tegelijk ( vs 1 template/reactie)
▪ miniaturisatie van reacties
▪ integratie van het proces
directe detectie (<> scheiding via gel)
1 proces i.p.v. verschillende stappen
Gebaseerd op 4 basisstappen:
STAP 1: aanmaak next-generation sequencing DNA library
library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates
types DNA library:
~ WGS
~ WES
~ targeted sequencing
~ amplicon sequencing
~ minimum bias en voldoende complexiteit (voldoende verschillende fragmenten)
7
,kwaliteitscontrole input DNA:
▪ hoeveelheid en concentratie
▪ zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
▪ integriteit bv capillaire elektroforese
stappen:
1) fragmentatie
fysisch: nebulizatie, sonicatie, acoustic shearing
enzymatisch: DNAse, fragmentase
2) eventueel target aanrijking
3) end repair
blunt ends maken:
o T4 DNA polymerase: afknippen fragmenten
o Klenow fragmenten : aanvullen van fragmenten
5’ uiteinde fosforyleren door T4 polynucleotide kinase
o Fosforylatie ! voor adaptoren vast te hangen
eventueel non-template A aan 3’ uiteinde door Taq polymerase
4) ligatie adaptors
adaptor = stukje gekende sequentie, bindt & sequencing primer + barcode
ligatie met uiteinden: sticky end met 3’A overhang of blunt-end ( A bindt aan T)
om bank te kunnen amplificeren via PCR & zodanig dat sequencing primers
kunnen binden
5) eventueel tagmentatie
fragmenteren + adaptors aanhechten in 1 stap
transposase enzym knipt en voegt adaptors toe
PCR cycli met toevoeging extra barcode aan adaptor
8
,6) size selection
doel: gewenste lengte insert selecteren
vroeger: agarose gel elektroforese, gewenste lengte uitsnijden en opzuiveren
nieuw: magnetische beads aan DNA & verhouding DNA/beads geeft lengte:
o 1-zijdig of 2-zijdig: te lange fragmenten uitselecteren & wegfilteren
o 1-zijdig: korte fragmenten : zoals adapter-dimeren wegfilteren
o 2-zijdig: kleine & grote fragmenten
7) Kwaliteitscontrole
gewenste lengte en concentratie inserts controleren
capillaire elektroforese
9
, STAP 2: klonale in vitro amplificatie
100-200 miljoen clusters van telkens 1000 kopieën van zelfde DNA template
Doel: simultaan maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
verschillende methoden om scheiding tussen clusters te behouden
Emulsie PCR Solid-phase template walking ‘wildfire’
Bv: 454 Bv SOLiD
Beads met nt complementair aan adaptoren Oppervlak met nt complementair adaptoren
Toevoeging PCR reagentia Fragmentatie laten binden
Olie-emulsie maken: beads van elkaar scheiden door Partiële denaturatie (T lichtjes los)
olie : vrij uiteinden (adaptor) ‘wandelen’ lokaal & binden
In elke microdruppel: 1 bead met 1 fragment op naburige primer
On-bead amplificatie in emulsie Amplificatie: 1000den lokale clusters
Solid-phase bridge amplificatie Rolling-circle amplificatie in oplossing
Bv ilumina Bv complete genomics
Vaste opp met nt complementair adaptoren 4 adaptoren (rood) ligeren aan fragment
Fragmenten vormen lokaal bruggetje via brownse Circulaire DNA template via ligatie
beweging Knippen downstream met type III endonuclease
PCR 2e set adaptoren: ligatie, circiuarisatie & knippen
Clusters (polonies) = 1000den kopieën van zelfde Herhalen met nog 2 andere adaptoren
DNA molecule gebonden op 1-2 microm spot Rolling circle amplificatie
Clusters = nanoballs = concatemeren = lange DNA
moleculen met meerdere kopieën van template na
elkaar
Hybridisatie op vaste drager
10
Methoden in biomedisch onderzoek
Kernthema’s van methoden 3
Van één (enkele) molecule(n) naar omics
▪ Next generation sequencing
▪ Massive parallel sequencing
▪ Nanopore sequencing
Multi-omics = data bij elkaar brengen om een compleet beeld te krijgen
Van ‘bulk’ naar ‘single cell’
▪ Bulk analyse = weefsel nemen, in mixer steken en zo alle klassen van moleculen nagaan
Output is gemiddelde van volledige weefsel
└ Vb. spatiale transcriptomics om na te gaan welk transcript op welke plaats & zo
verschillende celtypes zien
▪ Single cell analyse = cellen uit weefsel halen en omics doen op single cellen
Ruimtelijke informatie verloren
└ Vb. single cell transcriptomics om cellen uit elkaar te halen en te mappen
Interactomics = interacties tussen moleculen nagaan
Pathway analyse en fluxomics
▪ Via merkersubstraat (vb. C13 gemerkt glucose) volgen wat er gebeurt & zien hoe het
metabolisme is veranderd in een bepaalde ziekte
Genmodulatie = aantonen dat gen rol speelt in ziekte door gen te veranderen
1
,2
, DNA (2)
A: DNA SEQUENTIEBEPALING
methoden:
1) first-generation sequencing
o bulk sequencen
o Sanger, cloneren & elektroforese
o gouden standaard voor kleine projecten
2) second- / next-generation sequencing
o massief parallel sequencen ( miljoenen tegelijk)
o via clonaal geamplificeerde DNA moleculen
o bv ilumina
3) third- / next-next-generation sequencing
o individuele DNA moleculen sequencen zonder eerst amplificeren
o bv nanopore
➔ evolutie in capaciteit, snelheid en kosten
toepassingen:
▪ de novo genoom sequentiebepaling
ongekende genomen, nieuwe organismen ( bv Sars-CoV-2)
gedeeltelijk of volledig
in stukken gebeuren, dan kijken naar overlaps & vervolgens aan elkaar hangen
bv: humaan genoom project
▪ resequencing
mutaties = zeldzame veranderingen gelinkt aan ziektes
verschillen tussen individuen (SNPs)
referentiegenoom voor nieuwe individuen
gekend genoom van organisme
▪ sequentiebepaling als teller
aantallen DNA of RNA moleculen bepalen als teller
weten hoe vaak bepaald gen tot expressie komt in bepaald weefsel
RNAseq, ChiPseq,…
3
,1: 1ste generatie sequentiebepaling
Maxam & Gilbert
principe:
▪ differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties
▪ dan scheiding op gel volgens grootte
▪ dan visualisatie via autoradiografie
korte fragmenten
niet helemaal specifiek
werking:
analyse van de radio-actieve bandjes met de korte fragmentjes onderaan en de lange bovenaan.
Letter G boven de rij omdat enkel daar de bandjes een kleur geven. A & G omdat ze op die positie een
kleur geven.
4
,Sanger sequencing= dideoxy-keten terminatiemethode
principe:
▪ template/matrijs
: gefragmenteerd genoom geamplificeerd door kloneren / specifiek fragment geamplificeerd
door PCR
▪ polymerase + primer + mengsel 4 dNTPs + ddNTPs, elk met ander fluorescent label
▪ reactie loopt na inbouwen dNTP & stopt na inbouwen ddNTP
▪ !! verhouding dNTPs/ddNTPs
▪ Scheiden strengen: gel of capillair : elektroferogram
▪ 1 streng per keer aflezen
▪ 2 reacties voor betrouwbaarheid (FW en RV primer) = beide richtingen aflezen
beperkt tot 500 bp
moeite met herhalingen
Groen template: via polymerase maak je nieuwe DNA dat vertrekt vanuit een primer.
4dNTP’s & kleine hoeveelheid ddNTP’s. waarom dd? DNA is altijd deoxy ( zuurstof minder). Di omdat
er een H staat i.p.v. een OH. Aan de O kan er niets gebonden worden waardoor de reactie wel door kan
gaan.
▪ kwaliteitsscores = Phred score
o -10log10(P)
o 1ste 30 bp niet afleesbaar
o Meestal 500-700 bp goede sequentie afleesbaar
o P = probabiliteit van foutieve base call
o als Q=30 ⇒ 1/1000 kans op een fout
5
,verwezenlijkingen met 1ste generation sequencing:
a) human genome project (HGP)
~ grootste multinationale biologisch project ooit
~ stalen meerdere anonieme individuen
~ methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode
~ clones in YACs, BACs, P1s en cosmiden
1) mapping & fragmentatie
2) automatische sample bereiding & sequentiebepaling
3) elke 24u publieke vrijgave sequenties
4) draft sequentie 2001
5) finale sequentie 2003
b) human genome sequencing door Celera
~ Door Craig Venter
~ Stalen van 5 individuen
~ Methode: whole genome shotgun sequencing
~ Draft sequentie 2001
Enorme impact op
▪ Technologische ontwikkeling van sequencing
▪ Grote ontwikkeling van bioinformatica
▪ Visie op delen van data
▪ Andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
▪ Biologische kennis
Nieuwe uitdagingen
▪ Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
▪ Meer genomen sequencen van meerdere species
▪ Meer individuele humane sequenties
▪ Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
▪ Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
▪ Farmacogenomics verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren
op geneesmiddelen
▪ Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
▪ Therapie op maat
Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten → andere technologie
nodig met hoge capaciteit en lage kosten
6
,2: 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation sequencing
doel:
▪ veel hogere throughput aan veel lagere kosten ⇒ massale DNA sequentiebepaling mogelijk
▪ richtdoel: 1 humaan genoom op toestel per dag voor < 1000USD
Voordelen Nadelen
Snelheid Read lengte 35-700 bp (<sanger)
Kost Throughput geeft grote absolute hoeveelheid fouten
Accuraatheid: 85 – 99.9%
Weinig input nodig
Drie technieken van sequencing:
1) WGS whole genome sequencing
2) WES whole exome sequencing
3) targetted sequencing (specifieke gewenste regio’s)
Ontwikkeling van SGS met 3 pijlers:
▪ parallelle detectie = massieve parallel sequencing
cluster/ polony = kopieën van DNA template die ruimtelijk dicht bij elkaar liggen
klonale in vitro amplificatie van template
: duizenden-milj kkopieën van DNA template per cluster
multiplexing = veel clusters tegelijk ( vs 1 template/reactie)
▪ miniaturisatie van reacties
▪ integratie van het proces
directe detectie (<> scheiding via gel)
1 proces i.p.v. verschillende stappen
Gebaseerd op 4 basisstappen:
STAP 1: aanmaak next-generation sequencing DNA library
library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates
types DNA library:
~ WGS
~ WES
~ targeted sequencing
~ amplicon sequencing
~ minimum bias en voldoende complexiteit (voldoende verschillende fragmenten)
7
,kwaliteitscontrole input DNA:
▪ hoeveelheid en concentratie
▪ zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
▪ integriteit bv capillaire elektroforese
stappen:
1) fragmentatie
fysisch: nebulizatie, sonicatie, acoustic shearing
enzymatisch: DNAse, fragmentase
2) eventueel target aanrijking
3) end repair
blunt ends maken:
o T4 DNA polymerase: afknippen fragmenten
o Klenow fragmenten : aanvullen van fragmenten
5’ uiteinde fosforyleren door T4 polynucleotide kinase
o Fosforylatie ! voor adaptoren vast te hangen
eventueel non-template A aan 3’ uiteinde door Taq polymerase
4) ligatie adaptors
adaptor = stukje gekende sequentie, bindt & sequencing primer + barcode
ligatie met uiteinden: sticky end met 3’A overhang of blunt-end ( A bindt aan T)
om bank te kunnen amplificeren via PCR & zodanig dat sequencing primers
kunnen binden
5) eventueel tagmentatie
fragmenteren + adaptors aanhechten in 1 stap
transposase enzym knipt en voegt adaptors toe
PCR cycli met toevoeging extra barcode aan adaptor
8
,6) size selection
doel: gewenste lengte insert selecteren
vroeger: agarose gel elektroforese, gewenste lengte uitsnijden en opzuiveren
nieuw: magnetische beads aan DNA & verhouding DNA/beads geeft lengte:
o 1-zijdig of 2-zijdig: te lange fragmenten uitselecteren & wegfilteren
o 1-zijdig: korte fragmenten : zoals adapter-dimeren wegfilteren
o 2-zijdig: kleine & grote fragmenten
7) Kwaliteitscontrole
gewenste lengte en concentratie inserts controleren
capillaire elektroforese
9
, STAP 2: klonale in vitro amplificatie
100-200 miljoen clusters van telkens 1000 kopieën van zelfde DNA template
Doel: simultaan maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
verschillende methoden om scheiding tussen clusters te behouden
Emulsie PCR Solid-phase template walking ‘wildfire’
Bv: 454 Bv SOLiD
Beads met nt complementair aan adaptoren Oppervlak met nt complementair adaptoren
Toevoeging PCR reagentia Fragmentatie laten binden
Olie-emulsie maken: beads van elkaar scheiden door Partiële denaturatie (T lichtjes los)
olie : vrij uiteinden (adaptor) ‘wandelen’ lokaal & binden
In elke microdruppel: 1 bead met 1 fragment op naburige primer
On-bead amplificatie in emulsie Amplificatie: 1000den lokale clusters
Solid-phase bridge amplificatie Rolling-circle amplificatie in oplossing
Bv ilumina Bv complete genomics
Vaste opp met nt complementair adaptoren 4 adaptoren (rood) ligeren aan fragment
Fragmenten vormen lokaal bruggetje via brownse Circulaire DNA template via ligatie
beweging Knippen downstream met type III endonuclease
PCR 2e set adaptoren: ligatie, circiuarisatie & knippen
Clusters (polonies) = 1000den kopieën van zelfde Herhalen met nog 2 andere adaptoren
DNA molecule gebonden op 1-2 microm spot Rolling circle amplificatie
Clusters = nanoballs = concatemeren = lange DNA
moleculen met meerdere kopieën van template na
elkaar
Hybridisatie op vaste drager
10
