Moleculaire diagnostiek
1. Inleiding tot opsporen van DNA-variaties
1.1 Op niveau van chromosomen
1.1.1 Polyploïdie en trisomie
• Polyploïdie
o Het aantal chromosomen in een cel is groter dan 2
• Trisomie
o Van een chromosoom zijn er 3 stuks aanwezig
o Ontstaan door non-disjunctie tijdens de meiotische deling
1.1.2 Chromosomale translocaties
• Reciproke
o Wederkerige uitwisseling tussen DNA-segmenten van
2 niet-homologe chromosomen
• Niet-reciproke translocaties komen eveneens voor en hier
gaat het veelal over inversies binnen hetzelfde chromosoom
• Mogelijke gevolgen voor fenotype na translocatie:
o Breekpunt kan in een gen liggen en functie verstoren
o Gen kan onder invloed van andere promotor komen
o Breekpunt kan in een gen liggen en er kan een
hybride gen gecreëerd worden
1.1.3 Chromosomale deleties en inserties
• Deletie = verwijderen
• Insertie = toevoegen
1.1.4 Duplicaties
• Ontstaan door oneven crossing-over
tijdens de meiose, waarbij een
chromosoom tweemaal een bepaald DNA-
fragment draagt
1.1.5 Trinucleotide repeats
• Herhalingen van 3 nucleotiden hebben
verhoogd copy nummer tot ze de threshold
over gaan en worden ze onstabiel
1.2 Op niveau van DNA
1.2.1 SNPs en INDELs
• SN(i)Ps = single nucleotide polymorhism (basepaarsubstituties)
• INDELs = samentrekking van kleine deleties en inserties
• Missense mutatie = basensubstitutie leidt tot een aminozuur verandering
• Nonsense mutatie = codon verandert in STOPcodon, verkorte eiwit is meestal niet
functioneel en wordt snel afgebroken door de cel
• Anti-nonsense mutaties = stopcodon muteert naar codon voor een AZ, eiwit wordt langer
• Silent mutaties = basenpaarverandering geeft geen aanleiding tot AZ-verandering
1
, • INDELs-basenpaardeleties en inserties = deletie of insertie van 1 of meerdere basenparen in
coderende regio kan leiden tot verschil in fenotype
• Splice site mutaties = tijdens verwijderen van intron uit de pre-mRNA wordt er gebruik
gemaakt van consensussequenties, als signaalnucleotiden veranderen, wordt de splice-
machinerie van cel misleid en het intron wordt niet of deels verwijderd
• Transcriptionele mutaties = mutaties in 5’ of 3’-flankeerde genregio’s die het transcriptie
niveau van het gen veranderen
• Mutaties die translatie aantasten = door mutatie kan de efficiëntie van de mRNA binding
aan het ribosoom veranderen
1.2.2 Epigenetische variatie op DNA methylatie van C-residuen
2. Moleculaire diagnostiek
2.1 Moleculaire diagnostiek: wat en waarom?
• qPCR
2.2 Aandoeningen die bestudeerd worden in MD
• Monogene erfelijke aandoeningen
• Somatische defecten
• HLA-typering
• Infectieuze MO
2.2.1 MD voor erfelijke aandoeningen, verschillende levensstadia
• Chronologisch onderscheiden we volgende testen
o Pre-implantatie
o Prenataal
o Postnataal
▪ Neonataal (direct na de geboorte)
▪ Presymptomatisch
▪ Dragerschap bepalingen
2.2.1.1 Pre-implantatie
• Via PCR-onderzoek op embryonale stamcel van in vitro bevrucht embryo
2.2.1.2 Prenataal
• Testen op foetus
• Verschillende manieren om DNA van de foetus te verzamelen:
o Amnioncentese of vruchtwaterpunctie: 16-20 weken
▪ Cellen uit vruchtwater onderzocht op eventuele chromosoomafwijking
▪ Cellen in cultuur gebracht en gekweekt
▪ Na 3 weken resultaat
o Chorionvillibiopsie of vlokkentest: 9-12 weken
▪ Via buikwand of via vagina
▪ Stukje weefsel van placenta genomen
▪ Veel eerder uitvoerbaar
▪ Uitslag na enkele dagen beschikbaar
o NIPT (non invasieve prenatale test)
▪ Bloedonderzoek dat ten vroegste op 12 weken uitgevoerd kan worden
▪ DNA van baby dat in moederlijk bloed terecht is gekomen onderzocht
2
, 2.2.1.3 Neonataal
• Net na geboorte
• Aantal metabole aandoeningen
2.2.1.4 Presymptomatisch
• Eventuele mutaties opsporen, alvorens ziekte tot uiting komt
2.2.1.5 Carrier detectie
• Voor recessieve aandoeningen
3. Overzicht van de technieken
• Gekende variaties = gericht een bepaalde variant analyseren
• Ongekende variaties = nagaan of in DNA-sequentie variaties voorkomen
o Nieuw geanalyseerde DNA vergelijken met referentie
• Voor gekende ‘grotere’ mutaties (deleties, inserties, trinucleotidenexpansies,
translocaties,…)
o PCR en scheiding van de amplicons volgens lengte
o Multiplex-PCR en MLPA voor exondeleties in Duchenne spierdystrofiepatiënten
o FISH
o Southern blotting
• Voor gekende SNPs en INDELs
o Restrictie-enzym gebaseerde methoden
▪ RFLP-analyse
o Allele specific oligonucleotide (ASO) assays
▪ Hybridisatie aan capture probes, gebonden op vaste dragers
• Dot of slotblot assays
• SNP-chip
▪ Hybridisatie in oplossing
• Allel specifieke-PCR
• Via molecular beacons, FRET, lineaire probes
• Smeltcurve-analyse
o Ligatie-gebaseerde methoden
▪ OLA LCR
▪ MLPA
• Voor onbekende SNPs en INDELs
o SSCP (single strand conformation polymorphism)-analyse
o Heteroduplex analyse
• Voor gemethyleerde DNA-sequenties
o Restrictie-enzymdigesten
o Methylatiegevoelige PCR-bisulfietmethode
• High throughput SNP-detection
o SNP-minisequencing
o Pyrosequening
o Next en third generation sequencing
3
1. Inleiding tot opsporen van DNA-variaties
1.1 Op niveau van chromosomen
1.1.1 Polyploïdie en trisomie
• Polyploïdie
o Het aantal chromosomen in een cel is groter dan 2
• Trisomie
o Van een chromosoom zijn er 3 stuks aanwezig
o Ontstaan door non-disjunctie tijdens de meiotische deling
1.1.2 Chromosomale translocaties
• Reciproke
o Wederkerige uitwisseling tussen DNA-segmenten van
2 niet-homologe chromosomen
• Niet-reciproke translocaties komen eveneens voor en hier
gaat het veelal over inversies binnen hetzelfde chromosoom
• Mogelijke gevolgen voor fenotype na translocatie:
o Breekpunt kan in een gen liggen en functie verstoren
o Gen kan onder invloed van andere promotor komen
o Breekpunt kan in een gen liggen en er kan een
hybride gen gecreëerd worden
1.1.3 Chromosomale deleties en inserties
• Deletie = verwijderen
• Insertie = toevoegen
1.1.4 Duplicaties
• Ontstaan door oneven crossing-over
tijdens de meiose, waarbij een
chromosoom tweemaal een bepaald DNA-
fragment draagt
1.1.5 Trinucleotide repeats
• Herhalingen van 3 nucleotiden hebben
verhoogd copy nummer tot ze de threshold
over gaan en worden ze onstabiel
1.2 Op niveau van DNA
1.2.1 SNPs en INDELs
• SN(i)Ps = single nucleotide polymorhism (basepaarsubstituties)
• INDELs = samentrekking van kleine deleties en inserties
• Missense mutatie = basensubstitutie leidt tot een aminozuur verandering
• Nonsense mutatie = codon verandert in STOPcodon, verkorte eiwit is meestal niet
functioneel en wordt snel afgebroken door de cel
• Anti-nonsense mutaties = stopcodon muteert naar codon voor een AZ, eiwit wordt langer
• Silent mutaties = basenpaarverandering geeft geen aanleiding tot AZ-verandering
1
, • INDELs-basenpaardeleties en inserties = deletie of insertie van 1 of meerdere basenparen in
coderende regio kan leiden tot verschil in fenotype
• Splice site mutaties = tijdens verwijderen van intron uit de pre-mRNA wordt er gebruik
gemaakt van consensussequenties, als signaalnucleotiden veranderen, wordt de splice-
machinerie van cel misleid en het intron wordt niet of deels verwijderd
• Transcriptionele mutaties = mutaties in 5’ of 3’-flankeerde genregio’s die het transcriptie
niveau van het gen veranderen
• Mutaties die translatie aantasten = door mutatie kan de efficiëntie van de mRNA binding
aan het ribosoom veranderen
1.2.2 Epigenetische variatie op DNA methylatie van C-residuen
2. Moleculaire diagnostiek
2.1 Moleculaire diagnostiek: wat en waarom?
• qPCR
2.2 Aandoeningen die bestudeerd worden in MD
• Monogene erfelijke aandoeningen
• Somatische defecten
• HLA-typering
• Infectieuze MO
2.2.1 MD voor erfelijke aandoeningen, verschillende levensstadia
• Chronologisch onderscheiden we volgende testen
o Pre-implantatie
o Prenataal
o Postnataal
▪ Neonataal (direct na de geboorte)
▪ Presymptomatisch
▪ Dragerschap bepalingen
2.2.1.1 Pre-implantatie
• Via PCR-onderzoek op embryonale stamcel van in vitro bevrucht embryo
2.2.1.2 Prenataal
• Testen op foetus
• Verschillende manieren om DNA van de foetus te verzamelen:
o Amnioncentese of vruchtwaterpunctie: 16-20 weken
▪ Cellen uit vruchtwater onderzocht op eventuele chromosoomafwijking
▪ Cellen in cultuur gebracht en gekweekt
▪ Na 3 weken resultaat
o Chorionvillibiopsie of vlokkentest: 9-12 weken
▪ Via buikwand of via vagina
▪ Stukje weefsel van placenta genomen
▪ Veel eerder uitvoerbaar
▪ Uitslag na enkele dagen beschikbaar
o NIPT (non invasieve prenatale test)
▪ Bloedonderzoek dat ten vroegste op 12 weken uitgevoerd kan worden
▪ DNA van baby dat in moederlijk bloed terecht is gekomen onderzocht
2
, 2.2.1.3 Neonataal
• Net na geboorte
• Aantal metabole aandoeningen
2.2.1.4 Presymptomatisch
• Eventuele mutaties opsporen, alvorens ziekte tot uiting komt
2.2.1.5 Carrier detectie
• Voor recessieve aandoeningen
3. Overzicht van de technieken
• Gekende variaties = gericht een bepaalde variant analyseren
• Ongekende variaties = nagaan of in DNA-sequentie variaties voorkomen
o Nieuw geanalyseerde DNA vergelijken met referentie
• Voor gekende ‘grotere’ mutaties (deleties, inserties, trinucleotidenexpansies,
translocaties,…)
o PCR en scheiding van de amplicons volgens lengte
o Multiplex-PCR en MLPA voor exondeleties in Duchenne spierdystrofiepatiënten
o FISH
o Southern blotting
• Voor gekende SNPs en INDELs
o Restrictie-enzym gebaseerde methoden
▪ RFLP-analyse
o Allele specific oligonucleotide (ASO) assays
▪ Hybridisatie aan capture probes, gebonden op vaste dragers
• Dot of slotblot assays
• SNP-chip
▪ Hybridisatie in oplossing
• Allel specifieke-PCR
• Via molecular beacons, FRET, lineaire probes
• Smeltcurve-analyse
o Ligatie-gebaseerde methoden
▪ OLA LCR
▪ MLPA
• Voor onbekende SNPs en INDELs
o SSCP (single strand conformation polymorphism)-analyse
o Heteroduplex analyse
• Voor gemethyleerde DNA-sequenties
o Restrictie-enzymdigesten
o Methylatiegevoelige PCR-bisulfietmethode
• High throughput SNP-detection
o SNP-minisequencing
o Pyrosequening
o Next en third generation sequencing
3
