GENOOM DEEL 2 MOLECULAIRE TECHNIEKEN
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro
DNA-analyse technieken: RNA-analyse technieken:
1. PCR - aanwezigheid 1. (In-situ) hybridization – aanwezigheid en locatie
2. Restrictie-enzymen - aanwezigheid 2. cDNA maken – aanwezigheid en locatie
3. DNA-gelelectroforese - aanwezigheid 3. Kwantitatieve RT-PCR - hoeveelheid
4. Sanger sequening: dideoxy sequencing - sequentie 4. RNAseq (RNA sequencing) (-> wk9) - hoeveelheid,
5. Next generation sequencing (-> wk9) - sequentie aanwezigheid en sequentie
DNA-manipulatie technieken = Recombinant DNA-technologie
1. PCR 6. (Over)expressie
2. Restrictie-enzymen 7. Fusie-eiwitten en reporter-genen
3. DNA-klonering 8. RNA-interferentie dmv shRNA’s
4. Plaatsgerichte mutagenese 9. CRISPR-Cas9 gene editing (-> wk8)
5. Genomische banken en cDNA banken
Eiwit-analyse technieken (wk 8)
1. SDS-PAGE (SDS-Poly Acrylamide Gel-Electroforese)
2. Western Blotting
3. Fusie-eiwitten
4. GST-pulldown, Co-IP, ChIP
5. Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrophotometer)
DNA-ANALYSE TECHNIEKEN
Basisprincipe in veel DNA/RNA-technieken is hybridisatie
Hybridisatie: basenparing tussen complementaire DNA of RNA moleculen (enkelstrengs)
1. Denaturatie: dubbelstrengs -> enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs -> dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor dectectie van complementair gebied
-> specifiek stukje DNA/RNA van 20 nt is uniek
1. PCR: Polymerase Chain Reaction
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie (vermeerderen)
Voorwaarden:
De uiteinden van het stuk dat je wilt vermeerden, is bekend
Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)
Reden: je moet een stukje DNA dat je wilt onderzoeken eerst vermeerden, voordat je onderzoek naar
kan doen
Proces: Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. De strengen
worden uit elkaar gehaald door hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: foward en
reverse primer, dezelfde sequentie maar ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’
van target sequentie (3’ -> 5’): daarna m.b.v. Taq DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer
bevindt zich dus in geamplificeerde sequentie. Na 1 e paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die
de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook productie van DNA-fragment van alleen
specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt voor exponentiële toename.
,2. Restrictie-enzymen (endonucleases)
Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
Herkenning meestal een symmetrische sequentie (bv. GAAGTC / CTGAAG)
Binden vaak als dimeer
- Verschil lineair en circulair DNA
-> lineair DNA: 1x knippen = 2 fragmenten en 2x knippen = 3 fragmenten
-> circulair DNA: 1x knippen = 1 fragment en 2x knippen = 2 fragmenten
Herkennen en knippen specifiek patroon (meestal palindormisch) -> maken dsbreuk door
hydrolyse stap
Door restricite-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk omstaan:
- sticky ends: overhang kan (EcoRi, HindIII)
- blunds ends: zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang (Haell)
Let op: bij tekenen oriëntatie niet vergeten
Werking:
,3. DNA-gelelectroforese
Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
- De gel is een soort net/zeef waar stukjes DNA doorheen moeten
De agarose gel zit in een buffer, zodat de pH niet te veel veranderd en dus de DNA lading
niet veranderd.
Fragmenten migreren van - naar + pool
Kleinste fragmenten snelste naar + pool
Er wordt spanning toegevoegd zodat DNA (-) gaat bewegen naar (+)
1 DNA molecuul kan je NIET zien, je hebt meerdere nodig voor een streepje
Bandjes krijg je als je van één bepaalde grootte, veel fragmenten hebt
Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende
grootte in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je onbekende
grootte van de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig. DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
- Ethiumbrome en UV licht
- Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
- Fluorescent gelabelde nucleotiden
DNA-restictie-enzym analyse: digestie
Alle drie de bovenstaande technieken komen samen in digestie
Met deze techniek kan je bijvoorbeeld zien of iemand heterozygoot of homozygoot is
Stap 1: PCR een stukje van het gen waarin de SNP zich bevindt.
Stap 2: Voeg een restrictie-enzym toe dat wel in de ene en niet in de andere variant knipt
Stap 3: Bekijk het resultaat op een DNA-gel
4. Dideoxy (of Sanger) sequencing
Doel: vemeerderen EN sequentie te weten komen van DNA fragment (variant PCR)
1. Begin met PCR reactie: DNA-fragment amplificeren
2. Verdelen over 4 reageerbuisjes
3. Aan elk van de buisjes een kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen: ddATP, ddGTP, ddCTP
= dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep.
, 4. PCR uitvoeren. In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de
polymerisatie door DNA-polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stopt de verlenging
van de DNA-streng: er kunnen geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd.
5. Inhoud van 4 buisjes op 4 verschillende laantjes aanbrengen op een gel. Door middel van
gelelectroforese worden de verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar
gescheiden.
6. Nu kan je van beneden naar boven de sequentie van het stukje DNA aflezen.
Met geautomatiseerde dideoxy sequencing kan je DNA-fragmenten in de gel ook zichtbaar
maken door fluorescentie: ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
Er zijn 6 mogelijke leesframes. Je hebt dus verschillende open reading frames (startcodon-DNA-
stopcodon).
Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk -> teveel ddATP -> alleen maar GCATA fragmentjes en kan
je de sequentie niet achterhalen
Voorbeeld: buisje met ddATP: 5’ GCATA 3’ 5’ GCATATGTCA 3’ 5’ GCATATGTCAGTCCA 3’. De primer
die je gebruikt hebt is GCAT, vervolgens bouwt DNA polymerase nucleotiden aan de 3’kant. Het is
een kansproces wanneer er in het buisje met ddATP een A ingebouwd wordt, of het een normale ATP
of een ddATP is. Bij een ddATP stopt de reactie
Open leesframes zoeken
LET OP: je sequenced maar 1 enkelsstrengs DNA streng (ligt eraan welke primer je gebruikt welke
streng je sequenced) Je weet waar je primer zit en je weet welke primer je gebruikt hebt -> dus je
weet wat de 3’uiteinde en 5’uiteinde is. Je weet ook welke nucleotide er direct na de primer zit (want
je weet waar de primer stopt) -> je weet of je een forward of reverse primer hebt gebruikt, dus of de
sequentie die je hebt gekregen ook in het mRNA zit: forward primer gebruikt = precies dezelfde
sequentie als je DNA stukje en reverse primer gebruikt heb je de sequentie complementair is aan
stukje dat je wilt vermeerderen.
MAAR: als je dus niet weet of je sequentie hetzelfde is als de coderende sequentie (=mRNA
sequentie), dan zijn er 6 mogelijke leesramen (bv vraag op toets). Dan moet je dus zoeken naar Open
leesramen -> groepjes van 3 maken -> redelijk lang stuk tussen start- en stopcodon.
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro
DNA-analyse technieken: RNA-analyse technieken:
1. PCR - aanwezigheid 1. (In-situ) hybridization – aanwezigheid en locatie
2. Restrictie-enzymen - aanwezigheid 2. cDNA maken – aanwezigheid en locatie
3. DNA-gelelectroforese - aanwezigheid 3. Kwantitatieve RT-PCR - hoeveelheid
4. Sanger sequening: dideoxy sequencing - sequentie 4. RNAseq (RNA sequencing) (-> wk9) - hoeveelheid,
5. Next generation sequencing (-> wk9) - sequentie aanwezigheid en sequentie
DNA-manipulatie technieken = Recombinant DNA-technologie
1. PCR 6. (Over)expressie
2. Restrictie-enzymen 7. Fusie-eiwitten en reporter-genen
3. DNA-klonering 8. RNA-interferentie dmv shRNA’s
4. Plaatsgerichte mutagenese 9. CRISPR-Cas9 gene editing (-> wk8)
5. Genomische banken en cDNA banken
Eiwit-analyse technieken (wk 8)
1. SDS-PAGE (SDS-Poly Acrylamide Gel-Electroforese)
2. Western Blotting
3. Fusie-eiwitten
4. GST-pulldown, Co-IP, ChIP
5. Enzymactiviteit assays (m.b.v. spectrophotometer)
DNA-ANALYSE TECHNIEKEN
Basisprincipe in veel DNA/RNA-technieken is hybridisatie
Hybridisatie: basenparing tussen complementaire DNA of RNA moleculen (enkelstrengs)
1. Denaturatie: dubbelstrengs -> enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs -> dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor dectectie van complementair gebied
-> specifiek stukje DNA/RNA van 20 nt is uniek
1. PCR: Polymerase Chain Reaction
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie (vermeerderen)
Voorwaarden:
De uiteinden van het stuk dat je wilt vermeerden, is bekend
Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)
Reden: je moet een stukje DNA dat je wilt onderzoeken eerst vermeerden, voordat je onderzoek naar
kan doen
Proces: Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. De strengen
worden uit elkaar gehaald door hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: foward en
reverse primer, dezelfde sequentie maar ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’
van target sequentie (3’ -> 5’): daarna m.b.v. Taq DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer
bevindt zich dus in geamplificeerde sequentie. Na 1 e paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die
de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook productie van DNA-fragment van alleen
specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt voor exponentiële toename.
,2. Restrictie-enzymen (endonucleases)
Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
Herkenning meestal een symmetrische sequentie (bv. GAAGTC / CTGAAG)
Binden vaak als dimeer
- Verschil lineair en circulair DNA
-> lineair DNA: 1x knippen = 2 fragmenten en 2x knippen = 3 fragmenten
-> circulair DNA: 1x knippen = 1 fragment en 2x knippen = 2 fragmenten
Herkennen en knippen specifiek patroon (meestal palindormisch) -> maken dsbreuk door
hydrolyse stap
Door restricite-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk omstaan:
- sticky ends: overhang kan (EcoRi, HindIII)
- blunds ends: zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang (Haell)
Let op: bij tekenen oriëntatie niet vergeten
Werking:
,3. DNA-gelelectroforese
Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
- De gel is een soort net/zeef waar stukjes DNA doorheen moeten
De agarose gel zit in een buffer, zodat de pH niet te veel veranderd en dus de DNA lading
niet veranderd.
Fragmenten migreren van - naar + pool
Kleinste fragmenten snelste naar + pool
Er wordt spanning toegevoegd zodat DNA (-) gaat bewegen naar (+)
1 DNA molecuul kan je NIET zien, je hebt meerdere nodig voor een streepje
Bandjes krijg je als je van één bepaalde grootte, veel fragmenten hebt
Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende
grootte in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je onbekende
grootte van de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig. DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
- Ethiumbrome en UV licht
- Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
- Fluorescent gelabelde nucleotiden
DNA-restictie-enzym analyse: digestie
Alle drie de bovenstaande technieken komen samen in digestie
Met deze techniek kan je bijvoorbeeld zien of iemand heterozygoot of homozygoot is
Stap 1: PCR een stukje van het gen waarin de SNP zich bevindt.
Stap 2: Voeg een restrictie-enzym toe dat wel in de ene en niet in de andere variant knipt
Stap 3: Bekijk het resultaat op een DNA-gel
4. Dideoxy (of Sanger) sequencing
Doel: vemeerderen EN sequentie te weten komen van DNA fragment (variant PCR)
1. Begin met PCR reactie: DNA-fragment amplificeren
2. Verdelen over 4 reageerbuisjes
3. Aan elk van de buisjes een kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen: ddATP, ddGTP, ddCTP
= dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep.
, 4. PCR uitvoeren. In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de
polymerisatie door DNA-polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stopt de verlenging
van de DNA-streng: er kunnen geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd.
5. Inhoud van 4 buisjes op 4 verschillende laantjes aanbrengen op een gel. Door middel van
gelelectroforese worden de verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar
gescheiden.
6. Nu kan je van beneden naar boven de sequentie van het stukje DNA aflezen.
Met geautomatiseerde dideoxy sequencing kan je DNA-fragmenten in de gel ook zichtbaar
maken door fluorescentie: ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
Er zijn 6 mogelijke leesframes. Je hebt dus verschillende open reading frames (startcodon-DNA-
stopcodon).
Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk -> teveel ddATP -> alleen maar GCATA fragmentjes en kan
je de sequentie niet achterhalen
Voorbeeld: buisje met ddATP: 5’ GCATA 3’ 5’ GCATATGTCA 3’ 5’ GCATATGTCAGTCCA 3’. De primer
die je gebruikt hebt is GCAT, vervolgens bouwt DNA polymerase nucleotiden aan de 3’kant. Het is
een kansproces wanneer er in het buisje met ddATP een A ingebouwd wordt, of het een normale ATP
of een ddATP is. Bij een ddATP stopt de reactie
Open leesframes zoeken
LET OP: je sequenced maar 1 enkelsstrengs DNA streng (ligt eraan welke primer je gebruikt welke
streng je sequenced) Je weet waar je primer zit en je weet welke primer je gebruikt hebt -> dus je
weet wat de 3’uiteinde en 5’uiteinde is. Je weet ook welke nucleotide er direct na de primer zit (want
je weet waar de primer stopt) -> je weet of je een forward of reverse primer hebt gebruikt, dus of de
sequentie die je hebt gekregen ook in het mRNA zit: forward primer gebruikt = precies dezelfde
sequentie als je DNA stukje en reverse primer gebruikt heb je de sequentie complementair is aan
stukje dat je wilt vermeerderen.
MAAR: als je dus niet weet of je sequentie hetzelfde is als de coderende sequentie (=mRNA
sequentie), dan zijn er 6 mogelijke leesramen (bv vraag op toets). Dan moet je dus zoeken naar Open
leesramen -> groepjes van 3 maken -> redelijk lang stuk tussen start- en stopcodon.
