Samenvatting Biochemie en Celregulatie

Samenvatting Biochemie en Celregulatie
DNA replicatie:
Vanuit ORI gaat de replicatie beide kanten op:
replication bubble
-In iedere bubbel wordt het parentale dsDNA
ontwonden door helicase
-ss binding proteins zorgen voor stabilisatie en
voorkomen terugwinden DNA
-Topoisomerase voorkomt dat het nog dsDNA te
strak wordt opgewonden
-DNA synthese wordt gestart door een kort stuk
RNA primer. Hierachter kan DNA polymerase
binden

-DNA polymerase I vervangt de RNA primer met nucleotide DNA.
-DNA ligase plakt de DNA stukken van de lagging strand aan elkaar.

DNA word altijd gemaakt van richting 5´---nnnn---3’ -> Translatie leest ook af van 5’naar 3’
Je hebt maar 2 baseparen GC of AT




Aan de 5’ kant zit altijd een fosfaat groep -> als je hem eraf haalt = defosforilatie
-> als je de fosfaat groep erop doet is het fosforilering
Aan de 3’ groep zit altijd een OH groep
-> Ligatie: OH groep en Fosfaat(PO4) binden aan elkaar
-word gedaan door een ligase gebruiken rATP als energiebron

Terminus (uiteinde van eiwit)
-> C-terminus zit aan de 3’kant
-> N-terminus zit aan de 5’kant

Leading strand is naar de replicatie fork movement
Lagging strand is van de replicatie fork movement af

Er zijn 3 verschillende manieren van replicatie
->semi-conservative: strengen gaan uit elkaar
->conservative: word compleet gekopieërd
->dispersive: stukken gaan uit elkaar

Bij Dna replicatie gebruiken we semi-conservative

,Proofreading tRNA: als een verkeerd aminozuur gekoppeld wordt aan één van de tRNA’s die bedoeld
is voor een bepaald ander aminozuur (er zijn er namelijk meerdere) dan past het foute aminozuur
niet goed in de binding pocket van het enzym aminoacyl-tRNA synthetase (>20 verschillende
soorten). Het foute aminozuur wordt dan verwijderd.




Wanneer er een verkeerde base wordt gesignaleerd, gaat de
DNA polymerase een stap terug en wordt de ‘verkeerde’
base vervangen.

• 3’  5’ exonuclease 5’ 3’ exonuclease

• Niet alle polymerases hebben deze activiteit

• Taq polymerase

Nuclease kan nucleotiden polymeren afbreken -> meerdere
vormen
->exo 5’->3 of 3’-5’ of beide -> van buiten
->endo (restrictie enzyme) hebben een specificiteit -> van binnen




repair van een mismatch:

 Detectie van een mismatch

 DNA streng wordt geknipt

 DNA polymerase vult ontbrekende dNTP’s in

 Ligase lijmt de fragmenten aan elkaar

Daar naast bestaan er nog andere vormen van DNA
repair.
-> Nonhomologous End Joining (NHEJ
-> Homologous Recombination Repair (HRR).




Reparatie van dubbelstrengs breuken

,Non homologous end joining (NHEJ)

 Exonuclease ontwindt en reorganiseert het
DNA rond de breuk

 DNA wordt bij elkaar gebracht, waarbij
beperkte baseparing plaatsvindt

 Rest van het DNA wordt ingevuld, waarbij
verschillende basen verloren gaan

 Indels, frameshift



Homologe recombinatie

Homologe recombinatie wordt ingezet wanneer tijdens
de replicatie van het DNA een breuk ontstaat in (of vlak
voor) de replicatievork. In een klein deel van de
dubbelstrengs breuken in niet-replicerend DNA, wordt
het DNA op dezelfde manier gerepareerd (i.p.v. met NHEJ).

 Het uiteinde van de dubbelstrengs breuk wordt gedigesteerd met 5’ exonuclease, zodat je
een enkelstrengs 3’ overhang krijgt.

 Eiwitten worden gerekruteerd naar het tweede, nog intacte chromosoom (Rad51 voor
eukaryoten en RecA bij prokaryoten)

 Deze eiwitten katalyseren de migratie (invasie) van het nog intacte chromosoom naar de
plaats van de dubbelstrengs breuk. Hierdoor komt de ‘goede’ kopie, zonder breuken of
fouten, als een soort matrix tegen de gebroken streng aan te liggen.

 Vervolgens bindt DNA polymerase aan de matrix én aan de gebroken streng, en gaat de juiste
baseparen invoegen aan de 3’ kant, vanaf de overhang.

 Ligase zet vervolgens het nieuw gerecombineerde DNA aan elkaar vast

 De fosfo-di-ester banden die tijdelijk tussen de twee chromosomen zijn gemaakt worden
doorgeknipt, waardoor weer twee aparte, volledige chromosomen ontstaan.

, Hoe met homologe recombinatie een gen uitschakelen:
Een knock-out kan worden gemaakt door een selectiemarker te flankeren met sequenties die
homoloog zijn aan het uit te knocken target gen. Na introductie in een cel vindt integratie plaats
d.v.m. homologe recombinatie.

Flankeren: het toevoegen van een DNA sequentie aan een DNA fragment
integratie: het proces waarbij een stuk DNA word ingevoegd in het genoom van een organisme

Hoe kun je testen of je te maken hebt met de gewenste homologe recombinatie of een willekeurige
integratie:
PCR met primers buiten de flankerende sequenties op zowel WT als mogelijke KO cellen. Bij voorkeur
primers op het insert.



Wobble base: de derde van het codon, is de eerste van het anticodon. In de
standaard codontabellen zie je dit terug: de aminozuren met meerdere
codons hebben vaak codons die alleen in de derde positie verschillen. Als
ze ook in de tweede positie verschillen hebben ze dus een ander tRNA
nodig. Daarom zijn er per aminozuur ook meerdere tRNA’s (en ook
meerdere kopieën van de genen overigens).
-> Verschillende codons voor hetzelfde aminozuur

Alles binnen een vakje heeft dezelfde eerste twee basen. De derde maakt
vaak niet uit en de verschillende codons coderen dan voor hetzelfde
aminozuur.




Als je human DNA in e coli zet maar de codon in ecoli niet word aangemaakt door teweinig ATP voor
dit bepaalde codon kun je het human DNA muteren om met een andere codon te doen of ATP voor
dat specifieke codon in E coli toevoegen zodat zij deze ook kunnen aanmaken.
 Voor sommige codons heeft E. coli niet zoveel tRNA moleculen. Dan duurt het langer voordat het
juiste aminozuur is ingebouwd. Door de concentratie van dit tRNA te verhogen óf door een ander
codon voor hetzelfde aminozuur te kiezen (mutatie) kan dit probleem worden opgelost