HCO8 DNA sequentie analyse
Sequentiereactie, wat heb je allemaal nodig voor een DNA sequentie reactie:
− dNTP’s
− ddNTP’s (stop dNTP)
− primer, het is belangrijk dat er maar 1 primer aanwezig is, zodat er 1 soort product ontstaat
waar de sequentie van bepaald wordt.
− Taq polymerase (is thermostabiel)
− DNA template, bijvoorbeeld een PCR product
− Buffer
− Magnesium (voor DNA polymerase)
Interne primers, bij DNA sequencing volgens de Sanger
methode kan je extra interne primers gebruiken naast je
universele primer als je een hele lange DNA streng hebt om
de sequentie van te achterhalen. Gemiddeld worden er
namelijk zo’n 800 baseparen gevormd na een primer en als
je DNA template groter is, moet je dus interne primers
toevoegen. Dit gebeurt dan in separate sequencing reacties.
ddNTP, dideoxy NTP, normaal hebben nucleotiden een 3’ OH groep die gebruikt wordt om
de fosfaatgroep van de volgende nucleotide eraan te koppelen. ddNTP’s hebben deze OH
groep niet en zorgen ervoor dat de DNA strand daar ophoudt. Als bij sanger sequencen
dus een ddNTP ingebouwd wordt, kan je streng niet meer langer gemaakt worden. Deze
ddNTP’s markeer je altijd, waardoor je kan zien op wat voor base een ddNTP termineert.
Cycle sequencing, in ons experiment wordt gebruik gemaakt
van cycle sequencing i.p.v. sanger sequencing. Hierbij wordt
gebruik gemaakt van een taq polyermase i.p.v. normaal
polymerase wat bij sanger sequencing gebruikt wordt.
Hierdoor kun je het DNA template meerdere keren
gebruiken. Het belangrijke verschil met PCR is dat hier maar 1
primer gebruikt wordt.
Fluorescentie, de ddNTP’s die ingebouwd worden, zijn
fluorescent getagd. Elke nucleotide heeft een andere kleur.
Door de fragmenten op grootte te rangschikken en
vervolgens naar de kleurtjes te kijken, kan je dus de sequentie
bepalen. Elk nucleotide
bevat eenzelfde
fluorescine donor zodat
je het product kan
aanstralen dit
geëxciteerde molecuul
zal deze excitatie
overdragen naar het
Sequentiereactie, wat heb je allemaal nodig voor een DNA sequentie reactie:
− dNTP’s
− ddNTP’s (stop dNTP)
− primer, het is belangrijk dat er maar 1 primer aanwezig is, zodat er 1 soort product ontstaat
waar de sequentie van bepaald wordt.
− Taq polymerase (is thermostabiel)
− DNA template, bijvoorbeeld een PCR product
− Buffer
− Magnesium (voor DNA polymerase)
Interne primers, bij DNA sequencing volgens de Sanger
methode kan je extra interne primers gebruiken naast je
universele primer als je een hele lange DNA streng hebt om
de sequentie van te achterhalen. Gemiddeld worden er
namelijk zo’n 800 baseparen gevormd na een primer en als
je DNA template groter is, moet je dus interne primers
toevoegen. Dit gebeurt dan in separate sequencing reacties.
ddNTP, dideoxy NTP, normaal hebben nucleotiden een 3’ OH groep die gebruikt wordt om
de fosfaatgroep van de volgende nucleotide eraan te koppelen. ddNTP’s hebben deze OH
groep niet en zorgen ervoor dat de DNA strand daar ophoudt. Als bij sanger sequencen
dus een ddNTP ingebouwd wordt, kan je streng niet meer langer gemaakt worden. Deze
ddNTP’s markeer je altijd, waardoor je kan zien op wat voor base een ddNTP termineert.
Cycle sequencing, in ons experiment wordt gebruik gemaakt
van cycle sequencing i.p.v. sanger sequencing. Hierbij wordt
gebruik gemaakt van een taq polyermase i.p.v. normaal
polymerase wat bij sanger sequencing gebruikt wordt.
Hierdoor kun je het DNA template meerdere keren
gebruiken. Het belangrijke verschil met PCR is dat hier maar 1
primer gebruikt wordt.
Fluorescentie, de ddNTP’s die ingebouwd worden, zijn
fluorescent getagd. Elke nucleotide heeft een andere kleur.
Door de fragmenten op grootte te rangschikken en
vervolgens naar de kleurtjes te kijken, kan je dus de sequentie
bepalen. Elk nucleotide
bevat eenzelfde
fluorescine donor zodat
je het product kan
aanstralen dit
geëxciteerde molecuul
zal deze excitatie
overdragen naar het
