Proteomics
Proteomics & proteome technology
Garry Corthals
Centrale dogma
DNA → RNA → eiwit
Klopt globaal, maar links met biologische processen en bijvoorbeeld metabolieten missen uit dit
model – daarnaast weet/ken je bijvoorbeeld niet meteen alle eiwitten als je de gehele DNA
sequentie kent
Het genoom is gedefinieerd en is statisch
Het proteome is ongedefinieerd en is dynamisch – eiwitten zijn erg belangrijk aangezien ze reageren
op veranderingen en omgeving
Proteome – the entire protein complement expressed by a genome in a cell, tissue type or wherever
Het proteome is dynamisch en complex – er zijn drie dingen die alleen bepaald/gemeten kunnen
worden met proteomics en niet met bijvoorbeeld genomics of transcriptomics
1. Spatial & temporal expression → eiwitten komen in andere mate tot expressie afhankelijk
van bijvoorbeeld het weefseltype of het levensstadium waarin het organisme zich bevindt –
gen expressie is niet gecorreleerd met eiwit expressie en aangezien bij ziektes over het
algemeen eiwit(functies) aangetast worden en medicijnen vaak op eiwitten inwerken is het
belangrijk om te weten welke eiwitten tot expressie komen en in welke mate
2. Post-translational modifications (PTMs) → 200-300 – spelen onder andere een rol bij
onset/maintenance van ziektes
3. Pathways, networks & complexes → eiwitten werken bijna nooit alleen – eiwitten geven
signalen aan elkaar door wat uiteindelijk leidt tot een respons – ook kunnen sommige
eiwitten alleen hun functie uitvoeren in complexen met andere eiwitten
Bottom-up proteomics → relies on proteolytic cleavage
Enzymatische digestie met een enzym waarvan bekend is waar het enzym knipt – hierdoor wordt het
eiwit gedegradeerd door kleinere peptiden die vervolgens met MS gemeten kunnen worden
Een mens heeft ongeveer 20.000 eiwitten – door digestie met trypsine wordt elk eiwit in gemiddeld
42 peptiden afgebroken – wanneer er ook nog eens 10 PTMs meegenomen moeten worden in de
meting moeten er 20.000 * 42 * 10 = 8,5 miljoen dingen geanalyseerd worden
Het proteome is dynamisch (spatial & temporal) kwantitatieve proteomics
Eiwitten dragen modificaties PTM analyse
Eiwitten opereren in clusters protein-protein interactions
De hoeveelheid eiwitten en de compositie van het proteome bepaald de staat van de cel →
diagnostische waarde en classificatie
,Massa spectometrie (MS)
Sample → purificeren van eiwitten → cleave to peptides → elutie van peptiden door bijvoorbeeld
liquid chromatografie (LC) → (tandem) MS
Op elk tijdstip wordt de massa van de peptiden bepaald die op dat moment van de kolom elueren
Modular en spatial organisatie van het proteome kan met een aantal methoden geëxploreerd
worden
- Eiwit-eiwit interacties & complexen
o Affiniteit purificatie
Antilichaam tegen een specifiek eiwit → dit eiwit
zuiveren samen met de eiwitten waarmee het
interacteert
o Correlation profiling
complexen scheiden op basis van grootte – daarna
MS → eiwitten die samen elueren komen
waarschijnlijk uit hetzelfde complex
- Topologie van eiwit complexen
o Chemical cross-linking
Eiwitten worden aan elkaar gecross-linked via de
residuen van de eiwitten die dicht bij elkaar zitten –
door deze peptiden/residuen te identificeren kan
bepaald worden hoe de eiwitten het complex vormen
en welke delen van het eiwit dicht bij het andere
eiwit zitten
- Stabiele complexen en transiente interacties
o Proximity labeling – BioID
Een biotine ligase wordt gefuseerd aan een eiwit van
interesse waardoor nabije eiwitten gebiotinyleerd
worden – deze eiwitten kunnen vervolgens gezuiverd
worden en met MS kan bepaald worden welke
eiwitten dit zijn
Kwantitatieve proteomics en personalized medicine zijn meestal gebaseerd op biomarkers die een
reflectie zijn van een biologische conditie of ziektestatus
Het complete proteome zou moeten bestaan uit alle mogelijke isoformen en modificatie statussen
van alle eiwitten die tot expressie komen, ook is het proteome niet statisch – dit is erg lastig om
helemaal in kaart te brengen
- Analytisch → het proteome is alles wat met MS gemeten kan worden
- Chromosoom-centrisch → chromosoom-bij-chromosoom representatie van alle genen
- Biologisch → identificatie en kwantificatie van minimaal één eiwit per genomische locus, tot
expressie gebracht bij een biologisch systeem
,Relatie tussen genoom en proteome
- Genoom zegt iets over de primaire structuur, de sequentie, van het eiwit
met een microarray kan daarnaast bepaald worden vanaf welk stadium een sequentie
geproduceerd wordt
- Secundaire structuur – vouwing- , tertiaire structuur – 3D- , quaternaire structuur –
oligomeren - en pathways kunnen niet of enigszins vastgesteld worden aan de hand van het
genoom
Systeem biologie → holistisch
Flow van informatie ontcijferen – hoe zijn componenten aan elkaar gerelateerd en hoever staan ze
van elkaar af in het gehele netwerk
Populatie screening
Screenen van de bevolking om zo gevallen van
ziekte en aandoening op te kunnen sporen
Longitudinale monitoring
Een persoon wordt over de tijd gemeten op o.a. aanwezigheid van de biomarker voor een ziekte –
kan zo ook kijken of behandeling wel/niet helpt tegen ziekte
Massa spectometrie
Om een massa spectrum te kunnen verkrijgen, moeten moleculen in gasvorm gebracht worden en
geïoniseerd worden
soft ionization → peptiden worden niet gefragmenteerd bij overgang van vloeibaar naar gas –
peptiden worden wel geladen zodat ze gemanipuleerd kunnen worden – versnelling en beweging
door een magnetisch veld
MALDI & ESI
- MALDI
o Er is een sample-matrix kristal – pulsed light wordt op kristal gestuurd – matrix wordt
geioniseerd – ionisatie overgedragen op peptiden – peptiden repel away from plate –
large peptides are repelled slower – into MS
o Voor hele weefsels
- ESI
o Liquid – taylor cone ontstaat – druppels uit de cone verdampen – spray verandert in
plume
o Ook multiple charged ions
o Tissue of cell extracts
, Quantitation
Garry Corthals
Absolute quantitation → in mol -
absolute hoeveelheid eiwitten/peptiden in
een vloeistof, cel etc.
Relative quantitation → in units –
concentratie bepalen aan de hand van een
interne standaard of een andere
fysiologische staat – up- of downregulatie
Kwantitatieve approaches
Kwantificatie kan gedaan worden door de intensiteit van peptiden met verschillende massa’s te
vergelijken → door het inbouwen van isotopen kunnen dezelfde peptiden andere massa’s hebben
en vergeleken worden
Kan bijvoorbeeld een soort cellen laten groeien op medium met C13-gelabelde aminozuren
waardoor deze eiwitten zwaarder worden – kan fold-change bepalen van een conditie over een
controle conditie
- Stable isotope labeling
- Isotope dilution
- Lable free
Biologische labeling
Cellen worden na opgroeien/harvesting bij elkaar gemixt en hetzelfde behandeld
- geen lastig protocol
- geen purificatie stappen
- errors in sample processing beïnvloeden kwantificatie niet
maar:
- alleen voor celculturen
- biologisch effect van isotopen niet bekend
Chemische labeling
Chemische modificaties na harvest
- pro: kan affinity tag toevoegen en zo specifieke peptiden purificeren
- pro: voor elk type sample bruikbaar, niet alleen celculturen
- con: kan PTMs niet meten
Labeling → incorporeren van een massa verschil zodat in MS of MS/MS verschil in expressie van
peptiden bepaald kan worden
Proteomics & proteome technology
Garry Corthals
Centrale dogma
DNA → RNA → eiwit
Klopt globaal, maar links met biologische processen en bijvoorbeeld metabolieten missen uit dit
model – daarnaast weet/ken je bijvoorbeeld niet meteen alle eiwitten als je de gehele DNA
sequentie kent
Het genoom is gedefinieerd en is statisch
Het proteome is ongedefinieerd en is dynamisch – eiwitten zijn erg belangrijk aangezien ze reageren
op veranderingen en omgeving
Proteome – the entire protein complement expressed by a genome in a cell, tissue type or wherever
Het proteome is dynamisch en complex – er zijn drie dingen die alleen bepaald/gemeten kunnen
worden met proteomics en niet met bijvoorbeeld genomics of transcriptomics
1. Spatial & temporal expression → eiwitten komen in andere mate tot expressie afhankelijk
van bijvoorbeeld het weefseltype of het levensstadium waarin het organisme zich bevindt –
gen expressie is niet gecorreleerd met eiwit expressie en aangezien bij ziektes over het
algemeen eiwit(functies) aangetast worden en medicijnen vaak op eiwitten inwerken is het
belangrijk om te weten welke eiwitten tot expressie komen en in welke mate
2. Post-translational modifications (PTMs) → 200-300 – spelen onder andere een rol bij
onset/maintenance van ziektes
3. Pathways, networks & complexes → eiwitten werken bijna nooit alleen – eiwitten geven
signalen aan elkaar door wat uiteindelijk leidt tot een respons – ook kunnen sommige
eiwitten alleen hun functie uitvoeren in complexen met andere eiwitten
Bottom-up proteomics → relies on proteolytic cleavage
Enzymatische digestie met een enzym waarvan bekend is waar het enzym knipt – hierdoor wordt het
eiwit gedegradeerd door kleinere peptiden die vervolgens met MS gemeten kunnen worden
Een mens heeft ongeveer 20.000 eiwitten – door digestie met trypsine wordt elk eiwit in gemiddeld
42 peptiden afgebroken – wanneer er ook nog eens 10 PTMs meegenomen moeten worden in de
meting moeten er 20.000 * 42 * 10 = 8,5 miljoen dingen geanalyseerd worden
Het proteome is dynamisch (spatial & temporal) kwantitatieve proteomics
Eiwitten dragen modificaties PTM analyse
Eiwitten opereren in clusters protein-protein interactions
De hoeveelheid eiwitten en de compositie van het proteome bepaald de staat van de cel →
diagnostische waarde en classificatie
,Massa spectometrie (MS)
Sample → purificeren van eiwitten → cleave to peptides → elutie van peptiden door bijvoorbeeld
liquid chromatografie (LC) → (tandem) MS
Op elk tijdstip wordt de massa van de peptiden bepaald die op dat moment van de kolom elueren
Modular en spatial organisatie van het proteome kan met een aantal methoden geëxploreerd
worden
- Eiwit-eiwit interacties & complexen
o Affiniteit purificatie
Antilichaam tegen een specifiek eiwit → dit eiwit
zuiveren samen met de eiwitten waarmee het
interacteert
o Correlation profiling
complexen scheiden op basis van grootte – daarna
MS → eiwitten die samen elueren komen
waarschijnlijk uit hetzelfde complex
- Topologie van eiwit complexen
o Chemical cross-linking
Eiwitten worden aan elkaar gecross-linked via de
residuen van de eiwitten die dicht bij elkaar zitten –
door deze peptiden/residuen te identificeren kan
bepaald worden hoe de eiwitten het complex vormen
en welke delen van het eiwit dicht bij het andere
eiwit zitten
- Stabiele complexen en transiente interacties
o Proximity labeling – BioID
Een biotine ligase wordt gefuseerd aan een eiwit van
interesse waardoor nabije eiwitten gebiotinyleerd
worden – deze eiwitten kunnen vervolgens gezuiverd
worden en met MS kan bepaald worden welke
eiwitten dit zijn
Kwantitatieve proteomics en personalized medicine zijn meestal gebaseerd op biomarkers die een
reflectie zijn van een biologische conditie of ziektestatus
Het complete proteome zou moeten bestaan uit alle mogelijke isoformen en modificatie statussen
van alle eiwitten die tot expressie komen, ook is het proteome niet statisch – dit is erg lastig om
helemaal in kaart te brengen
- Analytisch → het proteome is alles wat met MS gemeten kan worden
- Chromosoom-centrisch → chromosoom-bij-chromosoom representatie van alle genen
- Biologisch → identificatie en kwantificatie van minimaal één eiwit per genomische locus, tot
expressie gebracht bij een biologisch systeem
,Relatie tussen genoom en proteome
- Genoom zegt iets over de primaire structuur, de sequentie, van het eiwit
met een microarray kan daarnaast bepaald worden vanaf welk stadium een sequentie
geproduceerd wordt
- Secundaire structuur – vouwing- , tertiaire structuur – 3D- , quaternaire structuur –
oligomeren - en pathways kunnen niet of enigszins vastgesteld worden aan de hand van het
genoom
Systeem biologie → holistisch
Flow van informatie ontcijferen – hoe zijn componenten aan elkaar gerelateerd en hoever staan ze
van elkaar af in het gehele netwerk
Populatie screening
Screenen van de bevolking om zo gevallen van
ziekte en aandoening op te kunnen sporen
Longitudinale monitoring
Een persoon wordt over de tijd gemeten op o.a. aanwezigheid van de biomarker voor een ziekte –
kan zo ook kijken of behandeling wel/niet helpt tegen ziekte
Massa spectometrie
Om een massa spectrum te kunnen verkrijgen, moeten moleculen in gasvorm gebracht worden en
geïoniseerd worden
soft ionization → peptiden worden niet gefragmenteerd bij overgang van vloeibaar naar gas –
peptiden worden wel geladen zodat ze gemanipuleerd kunnen worden – versnelling en beweging
door een magnetisch veld
MALDI & ESI
- MALDI
o Er is een sample-matrix kristal – pulsed light wordt op kristal gestuurd – matrix wordt
geioniseerd – ionisatie overgedragen op peptiden – peptiden repel away from plate –
large peptides are repelled slower – into MS
o Voor hele weefsels
- ESI
o Liquid – taylor cone ontstaat – druppels uit de cone verdampen – spray verandert in
plume
o Ook multiple charged ions
o Tissue of cell extracts
, Quantitation
Garry Corthals
Absolute quantitation → in mol -
absolute hoeveelheid eiwitten/peptiden in
een vloeistof, cel etc.
Relative quantitation → in units –
concentratie bepalen aan de hand van een
interne standaard of een andere
fysiologische staat – up- of downregulatie
Kwantitatieve approaches
Kwantificatie kan gedaan worden door de intensiteit van peptiden met verschillende massa’s te
vergelijken → door het inbouwen van isotopen kunnen dezelfde peptiden andere massa’s hebben
en vergeleken worden
Kan bijvoorbeeld een soort cellen laten groeien op medium met C13-gelabelde aminozuren
waardoor deze eiwitten zwaarder worden – kan fold-change bepalen van een conditie over een
controle conditie
- Stable isotope labeling
- Isotope dilution
- Lable free
Biologische labeling
Cellen worden na opgroeien/harvesting bij elkaar gemixt en hetzelfde behandeld
- geen lastig protocol
- geen purificatie stappen
- errors in sample processing beïnvloeden kwantificatie niet
maar:
- alleen voor celculturen
- biologisch effect van isotopen niet bekend
Chemische labeling
Chemische modificaties na harvest
- pro: kan affinity tag toevoegen en zo specifieke peptiden purificeren
- pro: voor elk type sample bruikbaar, niet alleen celculturen
- con: kan PTMs niet meten
Labeling → incorporeren van een massa verschil zodat in MS of MS/MS verschil in expressie van
peptiden bepaald kan worden
