Hoorcollege 3 Biologische geneesmiddelen, Upstream processing
à Crispr is een methode voor genetische modificatie.
Cas9 kan worden geprogrammeerd om specifieke
DNA-sequenties te herkennen en te knippen.
Het van interesse zit nu in een plasmide (zie rode
omlijning van waar we nu zitten in dit verhaal).
Upstream processing
ßDit figuur volledig kunnen
toelichten
1.Expressie vector
Expressie vector is een plasmide,
waarin je herkent: ORI (plek waar
DNA polymerase kan binden voor
replicatie), promoter (transcriptie),
gen van interesse, antibioticagenen.
Al deze elementen nodig om eiwit
goed tot expressie te laten komen in
cellen.
Hoe kiezen we de gastheer cellen om in te groeien?
Geneesmiddel moet veilig zijn voor toediening en moet werken (niet vanzelfsprekend voor
eiwitten door vouwing) à Afhankelijk van effectiviteit en veiligheid eisen van het
geneesmiddel
Posttranslationele modificaties (PTM’s): hoeveel stappen voordat eiwit therapeutisch effect
heeft?
• Glycosylering: functioneel
maken van eiwit door
suikergroepen in te
bouwen. Bepaald
werkzaamheid en
veiligheid
• Disulfide bruggen
(covalente koppeling
tussen twee zwavels)
à Vooral in eukaryote cellen,
veel minder in bacteriën
,Glycosylering
Koppelen van suikergroepen
• N-glycosylering
• O-glycosylering
à glycosylering in meerdere
celorganellen
à Begint in ER (eiwit gevormd in
ribosomen)
à Golgi (meerdere onderdelen van
het golgi, in elk onderdeel
koppeling van andere
suikergroepen)
Verschillende soorten eukaryoten
cellen hebben verschillende soorten glycosylerings patronen: andere
suikers op cellen
Prokaryoot kan niet glycosyleren! Te simpel in vergelijking met eukaryote
cellen
- S-S minder gecontroleerd
- Complexe eiwitvouwing moeilijker
Waarom is glycosylering belangrijk?
- Werkzaamheid (binding aan receptor bv.) overige argumenten à boek H1
- Veiligheid (immuunrespons tegen
niet-geglycosyleerde eiwitten)
Glycosylering verandert fysisch-chemische
eigenschappen
, Hoe verkrijgen we “de sequentie” voor een mAB?
Wat is een mAB: Complex eiwit
met onderdelen die altijd gelijk
zijn (constante regio’s) en
onderdelen die varieren (variabele
regio’s). Variable regio specifiek
voor een doelwit molecuul
(antigen). Er is dus niet “de
sequentie” voor mAB, dus cDNA
route werkt niet
àNiet als cDNA verkregen
à Doelwit wordt geïnjecteerdn(virus,…etc.)
Zelfstudie:
• Oorsprong variabel domein (muis, menselijk, chimeer, etc)
• Overige productiemethodes buiten hybridoma (gehumaniseerde muis, phage-display)
• Toepassingen voor analyse in het lab, ELISA, Western Blot (komen later terug in de cursus)
Pharmaceutical biotechnology p14-16 startpunt
à Crispr is een methode voor genetische modificatie.
Cas9 kan worden geprogrammeerd om specifieke
DNA-sequenties te herkennen en te knippen.
Het van interesse zit nu in een plasmide (zie rode
omlijning van waar we nu zitten in dit verhaal).
Upstream processing
ßDit figuur volledig kunnen
toelichten
1.Expressie vector
Expressie vector is een plasmide,
waarin je herkent: ORI (plek waar
DNA polymerase kan binden voor
replicatie), promoter (transcriptie),
gen van interesse, antibioticagenen.
Al deze elementen nodig om eiwit
goed tot expressie te laten komen in
cellen.
Hoe kiezen we de gastheer cellen om in te groeien?
Geneesmiddel moet veilig zijn voor toediening en moet werken (niet vanzelfsprekend voor
eiwitten door vouwing) à Afhankelijk van effectiviteit en veiligheid eisen van het
geneesmiddel
Posttranslationele modificaties (PTM’s): hoeveel stappen voordat eiwit therapeutisch effect
heeft?
• Glycosylering: functioneel
maken van eiwit door
suikergroepen in te
bouwen. Bepaald
werkzaamheid en
veiligheid
• Disulfide bruggen
(covalente koppeling
tussen twee zwavels)
à Vooral in eukaryote cellen,
veel minder in bacteriën
,Glycosylering
Koppelen van suikergroepen
• N-glycosylering
• O-glycosylering
à glycosylering in meerdere
celorganellen
à Begint in ER (eiwit gevormd in
ribosomen)
à Golgi (meerdere onderdelen van
het golgi, in elk onderdeel
koppeling van andere
suikergroepen)
Verschillende soorten eukaryoten
cellen hebben verschillende soorten glycosylerings patronen: andere
suikers op cellen
Prokaryoot kan niet glycosyleren! Te simpel in vergelijking met eukaryote
cellen
- S-S minder gecontroleerd
- Complexe eiwitvouwing moeilijker
Waarom is glycosylering belangrijk?
- Werkzaamheid (binding aan receptor bv.) overige argumenten à boek H1
- Veiligheid (immuunrespons tegen
niet-geglycosyleerde eiwitten)
Glycosylering verandert fysisch-chemische
eigenschappen
, Hoe verkrijgen we “de sequentie” voor een mAB?
Wat is een mAB: Complex eiwit
met onderdelen die altijd gelijk
zijn (constante regio’s) en
onderdelen die varieren (variabele
regio’s). Variable regio specifiek
voor een doelwit molecuul
(antigen). Er is dus niet “de
sequentie” voor mAB, dus cDNA
route werkt niet
àNiet als cDNA verkregen
à Doelwit wordt geïnjecteerdn(virus,…etc.)
Zelfstudie:
• Oorsprong variabel domein (muis, menselijk, chimeer, etc)
• Overige productiemethodes buiten hybridoma (gehumaniseerde muis, phage-display)
• Toepassingen voor analyse in het lab, ELISA, Western Blot (komen later terug in de cursus)
Pharmaceutical biotechnology p14-16 startpunt
