Week 4
Harvesting API from cell material
Wat belangrijk is om te bepalen hoe je een eiwit kan gaan zuiveren is om te weten waar deze
eiwitten worden geproduceerd. Daarnaast wil je weten wat voor cellen je kan gebruiken.
Mogelijkheden:
• Cellen: bacteriën, gisten, insecten cellen, plantencellen, hybridoma’s (antilichamen),
zoogdiercellen (CHO cellen bijvoorbeeld)
• Planten
• Dieren: melk, eieren
Het is belangrijk om functionele eiwitten te verkrijgen; eiwitten worden vaak geglycosileerd.
Verschillende cellen glycosileren op verschillende manieren. Ook als je sterke cellen gebruikt
zoals bijvoorbeeld bacterie- of schimmelcellen is het belangrijk na te denken hoe je deze
cellen gaat breken.
Waar is het eiwit?
Cellen hebben verschillende compartimenten en het is belangrijk om te weten waar in de
cellen de eiwitten worden geproduceerd (in de cellen? Buiten de cellen?). Dit bepaald van
welke techniek je gebruik gaat maken:
• In de cel
o Inclusion body: deel van samengevoegde eiwitten (geaggregeerde toestand) die
zich in bacteriecellen bevinden. Makkelijk te oogsten en hierna moet je ze
weer oplossen (omkeren van de geaggregeerde toestand)
o Periplasma: compartement tussen de binnen- en buitenmembraan. In dit geval
dient alleen de buitenkant van de cel te worden gebroken, daar de binnenkant
intact kan blijven. Zo blijven andere eiwitten en het DNA in de cel.
o Cytoplasma
o Plasmamembraan
• Excretie (makkelijker: alle cellen blijven intact)
o Cultuur medium
o Melk
o Eieren
o Seminal plasma
o Bloed
o Urine
Wat moet weg voor purificatie?
• Cellen (restant)
• Medium
• Membranen
• DNA
• Virussen
• Endotoxinen
• Andere eiwitten
, Voor purification moet het eiwit worden geoogst en oplosbaar worden gemaakt.
Er zijn verschillende manieren om de purificatie te starten. Als het eiwit zich in de cel
bevindt moet de cel worden verstoort. Hier zijn verschillende manieren voor:
• Gentle
o Osmotic shock
o Enzymatic lysis
o Detergent lysis
• Moderate
o Bead beating (e.g. glass beads)
o Freeze/thaw
• Harsh
o Grind (e.g. ceramic beads)
o Sonicate
o French press/ Manton Gaulin hogenizer (onder hoge druk de cellen doen barsten)
Pre-purificatie
• Centrifugeren ( cel
restanten, membranen
en deeltjes)
• Ultra-filtratie
(bufferuitwisseling en
concentratie)
• Filter (deeltjes, mogelijk
steriliseren) van virussen
afkomen
• Gel-filtratie (ontzouten)
• Fractional salting out
(wrede methode)
• Expanded bed absorption
,De "Expanded Bed Absorption" (EBA) methode is een eiwitzuiveringsmethode. In
deze techniek wordt een suspensie van biomateriaal, zoals geplette cellen,
geïntroduceerd in een kolom met chromatografische hars. Door vloeistof door de
kolom te pompen, ontstaat een "expanded bed," waarin het eiwit van belang aan het
hars bindt. Het niet-gebonden materiaal wordt weggespoeld, terwijl het gebonden
eiwit behouden blijft. Na het wassen wordt het eiwit geëlueerd en geoogst.
, From cell debris to purified protein
Hoe vang je je eiwit? Dit is de eerste stap in de purificatie van je eiwit van interesse.
Afhankelijk van de eigenschappen van je eiwit kan je gebruik maken van verschillende
purificatie technieken, zie de tabel hieronder:
Niet elke techniek kan voor alle stappen worden gebruikt:
1. IEX (ion exchange): Kan gebruikt worden in alle stappen; Eiwit vangen, intermediate
en polishing
2. HIC (hydrophobic interaction): Vooral intermediate
3. AC (Affinity chromatography): Alle stappen, polishing minder
4. GF (Gel filtration): Alleen polishing
5. RPC (Reversed phase): Alleen polishing (vooral peptiden)
Ion exchange chromatography
Het uitwisselen van ionen over een kolom.
Kolom met neg/pos lading en het eiwit met
een tegengestelde lading à trekt elkaar
aan. Eiwit van interesse blijft aan de kolom
door ion interactie. Andere eiwitten of
impurities binden niet aan de kolom en
komen er vanaf door de solvent
concentratie of pH te veranderen.
Harvesting API from cell material
Wat belangrijk is om te bepalen hoe je een eiwit kan gaan zuiveren is om te weten waar deze
eiwitten worden geproduceerd. Daarnaast wil je weten wat voor cellen je kan gebruiken.
Mogelijkheden:
• Cellen: bacteriën, gisten, insecten cellen, plantencellen, hybridoma’s (antilichamen),
zoogdiercellen (CHO cellen bijvoorbeeld)
• Planten
• Dieren: melk, eieren
Het is belangrijk om functionele eiwitten te verkrijgen; eiwitten worden vaak geglycosileerd.
Verschillende cellen glycosileren op verschillende manieren. Ook als je sterke cellen gebruikt
zoals bijvoorbeeld bacterie- of schimmelcellen is het belangrijk na te denken hoe je deze
cellen gaat breken.
Waar is het eiwit?
Cellen hebben verschillende compartimenten en het is belangrijk om te weten waar in de
cellen de eiwitten worden geproduceerd (in de cellen? Buiten de cellen?). Dit bepaald van
welke techniek je gebruik gaat maken:
• In de cel
o Inclusion body: deel van samengevoegde eiwitten (geaggregeerde toestand) die
zich in bacteriecellen bevinden. Makkelijk te oogsten en hierna moet je ze
weer oplossen (omkeren van de geaggregeerde toestand)
o Periplasma: compartement tussen de binnen- en buitenmembraan. In dit geval
dient alleen de buitenkant van de cel te worden gebroken, daar de binnenkant
intact kan blijven. Zo blijven andere eiwitten en het DNA in de cel.
o Cytoplasma
o Plasmamembraan
• Excretie (makkelijker: alle cellen blijven intact)
o Cultuur medium
o Melk
o Eieren
o Seminal plasma
o Bloed
o Urine
Wat moet weg voor purificatie?
• Cellen (restant)
• Medium
• Membranen
• DNA
• Virussen
• Endotoxinen
• Andere eiwitten
, Voor purification moet het eiwit worden geoogst en oplosbaar worden gemaakt.
Er zijn verschillende manieren om de purificatie te starten. Als het eiwit zich in de cel
bevindt moet de cel worden verstoort. Hier zijn verschillende manieren voor:
• Gentle
o Osmotic shock
o Enzymatic lysis
o Detergent lysis
• Moderate
o Bead beating (e.g. glass beads)
o Freeze/thaw
• Harsh
o Grind (e.g. ceramic beads)
o Sonicate
o French press/ Manton Gaulin hogenizer (onder hoge druk de cellen doen barsten)
Pre-purificatie
• Centrifugeren ( cel
restanten, membranen
en deeltjes)
• Ultra-filtratie
(bufferuitwisseling en
concentratie)
• Filter (deeltjes, mogelijk
steriliseren) van virussen
afkomen
• Gel-filtratie (ontzouten)
• Fractional salting out
(wrede methode)
• Expanded bed absorption
,De "Expanded Bed Absorption" (EBA) methode is een eiwitzuiveringsmethode. In
deze techniek wordt een suspensie van biomateriaal, zoals geplette cellen,
geïntroduceerd in een kolom met chromatografische hars. Door vloeistof door de
kolom te pompen, ontstaat een "expanded bed," waarin het eiwit van belang aan het
hars bindt. Het niet-gebonden materiaal wordt weggespoeld, terwijl het gebonden
eiwit behouden blijft. Na het wassen wordt het eiwit geëlueerd en geoogst.
, From cell debris to purified protein
Hoe vang je je eiwit? Dit is de eerste stap in de purificatie van je eiwit van interesse.
Afhankelijk van de eigenschappen van je eiwit kan je gebruik maken van verschillende
purificatie technieken, zie de tabel hieronder:
Niet elke techniek kan voor alle stappen worden gebruikt:
1. IEX (ion exchange): Kan gebruikt worden in alle stappen; Eiwit vangen, intermediate
en polishing
2. HIC (hydrophobic interaction): Vooral intermediate
3. AC (Affinity chromatography): Alle stappen, polishing minder
4. GF (Gel filtration): Alleen polishing
5. RPC (Reversed phase): Alleen polishing (vooral peptiden)
Ion exchange chromatography
Het uitwisselen van ionen over een kolom.
Kolom met neg/pos lading en het eiwit met
een tegengestelde lading à trekt elkaar
aan. Eiwit van interesse blijft aan de kolom
door ion interactie. Andere eiwitten of
impurities binden niet aan de kolom en
komen er vanaf door de solvent
concentratie of pH te veranderen.
