DT1 Ontwikkelingsbiologie – Hoorcolleges & COO’s
H1 Basic concepts in development biology
Somatische cel = alle cellen in lichaam buiten gameten
Germ cell (kiemcel) = produceert gameten
Twee manieren ontwikkeling
-mozaïek: embryo is een organisatie cellen die qua ontwikkelingspotentiaal al gedetermineerd zijn
-regulatief: cel fate is niet gefixeerd, maar bepaalt door condities
Klievingen
-geen groei, snelle celcyclus
-meroblastisch (membraan niet gesloten) en holoblastisch -> bepaald door hoeveelheid yolk
-typen celdelingen: (on)even en (a)symmetrisch
-radiaal = naast elkaar, spiraal = schuin
-hangt af van polariteit en inductie
Patroonformatie
-cellulaire activiteit spatiotemporeel bepaald
-Anterior-posterior, dorsaal-ventraal, links-rechts bepaald
-polariteit
Morfogenese -> orgaanvorming (gastrulatie)
-endoderm en mesoderm bewegen naar binnen -> vormen buik en lichaamsplan
-kiemlagen: ectoderm, mesoderm en endoderm
-apoptose
-celdood -> deel ontwikkelingsplan
-tenen en vingers zo gevormd
, -aangezet door BMP signaal
-celmigratie
-tijdens gastrulatie -> neurale lijst cellen uit neurale buis
-vormen hoofdstructuren, melanocyten, etc…
Celdifferentiatie en genexpressie
-bepaald door eiwitten gecodeerd door genen
-gereguleerd door transcriptiefactoren (TF)
-gecontroleerd door tijd en ruimte
-spatiotemporale genexpressie -> genexpressie verandert over tijd en plaats
-gecontroleerd door feedback loops -> hoe verder in tijd, hoe meer fate bepaald
-inductie = activatie transcriptiefactoren
Patroonvorming door positionele info
-morfogen gradiënt
-info volgt nog: french flag/source en sink
-assymetrische verdeling cytoplasmatische determinanten
-cel-cel communicatie
-laterale inhibitie , cellen interacteren met eigen ‘soort’
Determinatie cel fate
-gradueel proces -> langer in tijd -> meer commited
-stamcellen: toti (alle cellen), pluri (alle kiemlagen) en multi (alle weefsels)
-fate = wat cel later wordt
-specificatie = omdraaibaar -> niet compleet gedefineerd, gedetermineerd = niet omdraaibaar -> al
gedefineerd
COO Experimental approaches
Gene-expression profiling
Microarray:
-aanwezige mRNA uit weefsel
-geamplificeerd tot RNA of geconverteerd naar cDNA
-PCR vermeerderd
-nucleïnezuren getagt met fluorescente kleurstof + gehybridiseerd microarray.
Een chip bevat alle genen van een organisme. Verschil genexpressie door vergelijken
controlegroep uit zelfde weefsel. RNA in situ hybridisatie is het visualiseren van
homologe RNA sequenties gehybridiseerd (fluorescent) door een sonde.
RNA seq:
-mRNA uit cellen, gefragmenteerd, gekopieerd tot cDNA en geamplificeerd
-cDNAs getagged + gesequenced (grote hoeveelheden hoge-kwaliteit sequenties)
- geïdentificeerd mappen referentiegenoom.
De hoeveelheid expressie wordt gemeten in dichtheid van sequenties.
Mutagenesis screen: detecteren mutaties in organismen met een bepaald fenotype voor vinden gen.
Via injecteren van mutagenen of UV (vaak bij mannen door hoge spermaproductie). Organismen
gekruist en nageslacht bekeken op abnormaal fenotype.
Forward genetics, fenotype -> gen.
,Knock-out: één gen geïnactiveerd (functie achterhalen). Door:
Sequentie DNA (via E. coli plasmide) in cel vroeg embryo (blastocyst, pluripotent):
-Twee homologe recombinatie sites -> insertie celdeling (controle via drugsresistentie)
(Target gen: stop codon, GFP of functioneel gen (knock-in))
-Cellen (transgenic) in andere inner cell mass van ander blastocyst embryo.
-Chimera ontstaan voor identificeren (wit/bruin , zou kunnen ontstaan door opnemen tweling)
LoxP sequentie (34nt):
-voor en na gen geplaats
-toevoegen cre recombinase -> DNA vormt loop met alignde loxP
-cre knipt DNA en plakt uiteinden aan elkaar.
Transcriptionele road block:
-cre kort toegevoegd, block verwijdert -> kleureiwitten random gecodeerd
-promotor verschillende genen + individuele cellen labelen
-telkens één kleur gezien, 3’ uiteinde coderende regio stopcodon
Zien welke cel moedercel is, alle afstammelingen zelfde kleur
CRISPR-Cas9 vervangt beide:
-Eiwit knipt DNA, Cas9
-RNA molecuul sgRNA (20nt), Single Guide RNA (crRNA, herkenner, tracrRNA, bind aan Cas9).
-RNA streng matcht specifieke DNA na ontbinden Cas9
-Cas9 knipt streng (herstel onmogelijk -> mutaties -> knock-out (gedaan in bevruchte eicel)
Andere toepassingen na toevoegen enzym aan Cas9:
-enkele nucleotiden aanpassen (stopcodon of onschadelijk eiwit maken)
-activator aan guide-rna -> polymerase binden -> transcriptie activeren/silencen
-fluorescente eiwitten binden voor locatie genen
Gebreken: DNA op andere plekken dan target veranderen soms
, HC 2 Xenopus and Zebrafish + COO Mesoderm induction
Fylogenetische bomen chordaten en vertebraten:
-leven op land -> niet uitdrogen ei -> amnion (embryo vlies)
-aquatische soorten -> snel ontwikkelen door predatiedruk + veel eitjes
-voordeel landamnioten = beschermen ei op land / interne bevruchting -
> langere ontwikkeling -> andere processen evolueren
Vertebrate embryo karakteristieken
-ontwikkelen met anterior-posterior (kop-staart) en dorsaal-ventraal
(rug-buik)
-doorsnedes: transversaal (zoals hieronder), longtitutinaal (links/rechts-as)
1. Chorda -> Sonic Hedgehog afgifte, vroeg embryo fysieke ondersteuning
2. Neurale weefsels (dorsaal) -> uitgehold met vloeistof
3. Kieuwbogen in vroeg stadium, rudimentair -> vroege bloedsomloop met aortabogen
4. Post-anale staart, somatische groei loopt door
5. Mesoderm (paraxiaal) van anterior-posterior segmenteerd in geëpitheliseerde blokken,
de somiten (1 somiet = 1 wervel -> celdifferentiatie tot organen)
Xenopus leavis – kikker
-goed model: vertebraat, enigszins verwant aan mens, makkelijk
onderhoud, produceren hele jaar eieren, manipulatie makkelijk
1. oocyt bevrucht door spermacel
2. klievingsdelingen, holoblastisch (plasmamembraan tussen
cellen) (massa neemt niet toe, kleinere cellen)
3. blastocoel (holte in blastula)
4. gastrulatie, via blastopore (opening vegetatieve zijde) ->
kiemlagen gemaakt (basis kop-staart-as, oerdarm gemaakt)
5. neuraal systeem ontwikkelen (neurula stadium) – neurale
plaat naar neurale groeve, sluit aan bovenkant tot buis
6. segmentatie larvaal stadium
7. morfogenese (4 dagen)
Assen en fate maps Xenopus
-Animale pool (pigment) vormt dier, vegetale (zware) pool dooier
(maternale componenten)
H1 Basic concepts in development biology
Somatische cel = alle cellen in lichaam buiten gameten
Germ cell (kiemcel) = produceert gameten
Twee manieren ontwikkeling
-mozaïek: embryo is een organisatie cellen die qua ontwikkelingspotentiaal al gedetermineerd zijn
-regulatief: cel fate is niet gefixeerd, maar bepaalt door condities
Klievingen
-geen groei, snelle celcyclus
-meroblastisch (membraan niet gesloten) en holoblastisch -> bepaald door hoeveelheid yolk
-typen celdelingen: (on)even en (a)symmetrisch
-radiaal = naast elkaar, spiraal = schuin
-hangt af van polariteit en inductie
Patroonformatie
-cellulaire activiteit spatiotemporeel bepaald
-Anterior-posterior, dorsaal-ventraal, links-rechts bepaald
-polariteit
Morfogenese -> orgaanvorming (gastrulatie)
-endoderm en mesoderm bewegen naar binnen -> vormen buik en lichaamsplan
-kiemlagen: ectoderm, mesoderm en endoderm
-apoptose
-celdood -> deel ontwikkelingsplan
-tenen en vingers zo gevormd
, -aangezet door BMP signaal
-celmigratie
-tijdens gastrulatie -> neurale lijst cellen uit neurale buis
-vormen hoofdstructuren, melanocyten, etc…
Celdifferentiatie en genexpressie
-bepaald door eiwitten gecodeerd door genen
-gereguleerd door transcriptiefactoren (TF)
-gecontroleerd door tijd en ruimte
-spatiotemporale genexpressie -> genexpressie verandert over tijd en plaats
-gecontroleerd door feedback loops -> hoe verder in tijd, hoe meer fate bepaald
-inductie = activatie transcriptiefactoren
Patroonvorming door positionele info
-morfogen gradiënt
-info volgt nog: french flag/source en sink
-assymetrische verdeling cytoplasmatische determinanten
-cel-cel communicatie
-laterale inhibitie , cellen interacteren met eigen ‘soort’
Determinatie cel fate
-gradueel proces -> langer in tijd -> meer commited
-stamcellen: toti (alle cellen), pluri (alle kiemlagen) en multi (alle weefsels)
-fate = wat cel later wordt
-specificatie = omdraaibaar -> niet compleet gedefineerd, gedetermineerd = niet omdraaibaar -> al
gedefineerd
COO Experimental approaches
Gene-expression profiling
Microarray:
-aanwezige mRNA uit weefsel
-geamplificeerd tot RNA of geconverteerd naar cDNA
-PCR vermeerderd
-nucleïnezuren getagt met fluorescente kleurstof + gehybridiseerd microarray.
Een chip bevat alle genen van een organisme. Verschil genexpressie door vergelijken
controlegroep uit zelfde weefsel. RNA in situ hybridisatie is het visualiseren van
homologe RNA sequenties gehybridiseerd (fluorescent) door een sonde.
RNA seq:
-mRNA uit cellen, gefragmenteerd, gekopieerd tot cDNA en geamplificeerd
-cDNAs getagged + gesequenced (grote hoeveelheden hoge-kwaliteit sequenties)
- geïdentificeerd mappen referentiegenoom.
De hoeveelheid expressie wordt gemeten in dichtheid van sequenties.
Mutagenesis screen: detecteren mutaties in organismen met een bepaald fenotype voor vinden gen.
Via injecteren van mutagenen of UV (vaak bij mannen door hoge spermaproductie). Organismen
gekruist en nageslacht bekeken op abnormaal fenotype.
Forward genetics, fenotype -> gen.
,Knock-out: één gen geïnactiveerd (functie achterhalen). Door:
Sequentie DNA (via E. coli plasmide) in cel vroeg embryo (blastocyst, pluripotent):
-Twee homologe recombinatie sites -> insertie celdeling (controle via drugsresistentie)
(Target gen: stop codon, GFP of functioneel gen (knock-in))
-Cellen (transgenic) in andere inner cell mass van ander blastocyst embryo.
-Chimera ontstaan voor identificeren (wit/bruin , zou kunnen ontstaan door opnemen tweling)
LoxP sequentie (34nt):
-voor en na gen geplaats
-toevoegen cre recombinase -> DNA vormt loop met alignde loxP
-cre knipt DNA en plakt uiteinden aan elkaar.
Transcriptionele road block:
-cre kort toegevoegd, block verwijdert -> kleureiwitten random gecodeerd
-promotor verschillende genen + individuele cellen labelen
-telkens één kleur gezien, 3’ uiteinde coderende regio stopcodon
Zien welke cel moedercel is, alle afstammelingen zelfde kleur
CRISPR-Cas9 vervangt beide:
-Eiwit knipt DNA, Cas9
-RNA molecuul sgRNA (20nt), Single Guide RNA (crRNA, herkenner, tracrRNA, bind aan Cas9).
-RNA streng matcht specifieke DNA na ontbinden Cas9
-Cas9 knipt streng (herstel onmogelijk -> mutaties -> knock-out (gedaan in bevruchte eicel)
Andere toepassingen na toevoegen enzym aan Cas9:
-enkele nucleotiden aanpassen (stopcodon of onschadelijk eiwit maken)
-activator aan guide-rna -> polymerase binden -> transcriptie activeren/silencen
-fluorescente eiwitten binden voor locatie genen
Gebreken: DNA op andere plekken dan target veranderen soms
, HC 2 Xenopus and Zebrafish + COO Mesoderm induction
Fylogenetische bomen chordaten en vertebraten:
-leven op land -> niet uitdrogen ei -> amnion (embryo vlies)
-aquatische soorten -> snel ontwikkelen door predatiedruk + veel eitjes
-voordeel landamnioten = beschermen ei op land / interne bevruchting -
> langere ontwikkeling -> andere processen evolueren
Vertebrate embryo karakteristieken
-ontwikkelen met anterior-posterior (kop-staart) en dorsaal-ventraal
(rug-buik)
-doorsnedes: transversaal (zoals hieronder), longtitutinaal (links/rechts-as)
1. Chorda -> Sonic Hedgehog afgifte, vroeg embryo fysieke ondersteuning
2. Neurale weefsels (dorsaal) -> uitgehold met vloeistof
3. Kieuwbogen in vroeg stadium, rudimentair -> vroege bloedsomloop met aortabogen
4. Post-anale staart, somatische groei loopt door
5. Mesoderm (paraxiaal) van anterior-posterior segmenteerd in geëpitheliseerde blokken,
de somiten (1 somiet = 1 wervel -> celdifferentiatie tot organen)
Xenopus leavis – kikker
-goed model: vertebraat, enigszins verwant aan mens, makkelijk
onderhoud, produceren hele jaar eieren, manipulatie makkelijk
1. oocyt bevrucht door spermacel
2. klievingsdelingen, holoblastisch (plasmamembraan tussen
cellen) (massa neemt niet toe, kleinere cellen)
3. blastocoel (holte in blastula)
4. gastrulatie, via blastopore (opening vegetatieve zijde) ->
kiemlagen gemaakt (basis kop-staart-as, oerdarm gemaakt)
5. neuraal systeem ontwikkelen (neurula stadium) – neurale
plaat naar neurale groeve, sluit aan bovenkant tot buis
6. segmentatie larvaal stadium
7. morfogenese (4 dagen)
Assen en fate maps Xenopus
-Animale pool (pigment) vormt dier, vegetale (zware) pool dooier
(maternale componenten)
